[發明專利]一種用于生物學活性測定的質粒及其制備方法

有效

• 申請號: 201210066996.7
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN103305540A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 王晶翼;朱蕾;孫麗霞;車立平;王克波;李劍鳳;劉克玲
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/02;G01N21/31
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

1.一種用于生物學活性測定的質粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述用于生物學活性測定的質粒的制備方法，步驟如下：

(1)用限制性內切酶NheI和EcoRI雙酶切pCI-neo質粒，插入經限制性內切酶NheI和EcoRI雙酶切的表達調控元件，構建質粒pCIneo-ease；

(2)用限制性內切酶MluI和XbaI雙酶切步驟(1)制得的質粒pCIneo-ease，插入經限制性內切酶MluI和XbaI雙酶切的核糖體結合位點序列，構建質粒pCIneo-ease-IRES；

(3)用限制性內切酶XbaI和NotI雙酶切步驟(2)制得的質粒pCIneo-ease-IRES，插入經限制性內切酶XbaI和NotI雙酶切的潮霉素基因片段，構建真核表達載體pCIneo-ease-IRES-Hygromycin，即得用于生物學活性測定的質粒。

3.一種生物學活性測定細胞，該細胞含有權利要求1所述用于生物學活性測定的質粒。

4.權利要求3所述生物學活性測定細胞的制備方法，其特征在于，步驟如下：

(1)用限制性內切酶XhoI和MluI雙酶切用于生物學活性測定的質粒，插入經限制性內切酶XhoI和MluI雙酶切的細胞因子受體表達基因構建真核表達載體pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin；

(2)將步驟(1)制得的真核表達載體pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin以電擊轉化的方式導入到宿主細胞，得轉化細胞；

(3)將步驟(2)制得的轉化細胞以氨基糖苷類抗生素G418和潮霉素B進行篩選，獲得細胞群體，再加入細胞因子進行篩選，獲得表達受體M的細胞群體；

(4)將步驟(3)制得的細胞群體進行單克隆篩選，獲得單克隆細胞株，即得。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中細胞因子受體表達基因是指細胞因子KGF、TPO、EPO或IL11的受體表達基因。

6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的電擊轉化，步驟如下：

收集處于對數生長期的宿主細胞；將生物學活性測定質粒加入到細胞懸液中，混合均勻，得細胞混合液；將細胞混合液加到電轉杯中；在脈沖強度為100V-600V條件下電擊7-20ms，即得。

7.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的生物學活性測定質粒的濃度為每百微升5-16μg；優選的，所述步驟(2)中的宿主細胞為32D細胞株；優選的，所述步驟(2)中的宿主細胞是經過預處理的宿主細胞，預處理過程如下：

將宿主細胞由液氮中取出，置于37℃水浴鍋中，使凍存的細胞在1分鐘內解凍，然后離心，棄上清，用完全培養基重懸細胞，在體積百分比為5％CO₂的培養箱內靜置培養，每三天進行傳代、擴培。

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，上述完全培養基，是向RPMI1640培養液中添加培養基總體積10％的滅活胎牛血清，再加入mIL-3，使mIL-3的終濃度達到10μg/ml。

9.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，在加入細胞因子篩選前，還包括去除mIL-3的步驟；優選的，所述步驟(3)中的細胞因子選自KGF、TPO、EPO或IL11。

10.權利要求1所述用于生物學活性測定的質粒、權利要求3所述生物學活性測定細胞在檢測生物制品中細胞因子KGF、TPO、EPO或IL11活性中的應用。