[發(fā)明專利]大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210066844.7
• 申請(qǐng)日: 2012-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN102534043A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬愛(ài)軍;劉慶明;黃智慧;王新安;楊志;曲江波;商曉梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京中偉智信專利商標(biāo)代理事務(wù)所 11325
• 代理人: 張岱

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子遺傳標(biāo)記研究技術(shù)，具體涉及一種檢測(cè)大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single?nucleotide?polymorphism，SNP)的方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記是基因組中最豐富的突變類型，因它數(shù)量多，覆蓋密度大，位點(diǎn)豐富，幾乎分布于整個(gè)基因組，具有片段短易于擴(kuò)增、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)；易于高通量、自動(dòng)化分析，易于遺傳機(jī)制的研究等優(yōu)勢(shì)，所以它是遺傳育種研究中的熱門領(lǐng)域。有關(guān)大菱鲆SNP標(biāo)記開發(fā)的研究，在本發(fā)明做出之前，國(guó)內(nèi)外有部分相關(guān)的報(bào)道，國(guó)內(nèi)湖北省林業(yè)科學(xué)研究院張新葉等(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2009)發(fā)表的基于EST序列的楊樹候選SNPs標(biāo)記分析，曾報(bào)道了利用生物信息學(xué)方法對(duì)來(lái)自2個(gè)不同cDNA文庫(kù)的2萬(wàn)余條楊樹EST序列進(jìn)行了候選SNPs標(biāo)記篩選的方法，但是研究對(duì)象并非大菱鲆，而且后期的驗(yàn)證方法為重新測(cè)序法，該方法需要的成本高，而且重新測(cè)序的樣品數(shù)量少，隨機(jī)誤差較大。豐貴鵬等(生命的化學(xué)2010)發(fā)表的高分辨率熔解曲線法的非標(biāo)記探針基因分型技術(shù)，曾報(bào)道了高分辨率熔解曲線技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，但只是綜述，對(duì)發(fā)明探索有一定幫助，沒(méi)有具體的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)路線參考。殷豪等(園藝學(xué)報(bào)2011)發(fā)表的利用高分辨率熔解曲線(HRM)分析梨微衛(wèi)星標(biāo)記，曾報(bào)道了利用高分辨率熔解曲線(HRM)分析微衛(wèi)星(即SSRs)序列多態(tài)性的方法，它是對(duì)已知位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)的精密度要求相對(duì)較低，而本發(fā)明不需要有已知突變位點(diǎn)這個(gè)前提，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)的精密度要求較高；西班牙Manuel?Vera等(Aquaculture2011)發(fā)表的Validation?of?single?nucleotide?polymorphism(SNP)markers?from?an?immune?Expressed?Sequence?Tag(EST)turbot，Scophthalmus?maximus，database，曾報(bào)道基于EST序列開發(fā)大菱鲆SNP標(biāo)記的方法，他運(yùn)用基于四種可能核苷酸兩步反應(yīng)法對(duì)候選SNP熒光檢測(cè)進(jìn)行基因分型驗(yàn)證，共篩選出77個(gè)大菱鲆SNP標(biāo)記。但是他們分析EST序列時(shí)，應(yīng)用的軟件是CAP3和QualitySNP，該軟件的運(yùn)行需要linux操作系統(tǒng)，操作相對(duì)繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測(cè)方法，該方法費(fèi)用低、特異性準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，可快速高通量地檢測(cè)大菱鲆C135TSNP標(biāo)記。

本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括：1)、基因組DNA提取；2)、候選SNP篩選；3)、引物、探針設(shè)計(jì)；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；5)、探針雜交；6)、數(shù)據(jù)采集；7)、基因分型，具體步驟如下：

1)、基因組DNA提取：提取大菱鲆基因組DNA，將其稀釋為20ng/ul；

2)、候選SNP篩選：采用Vector?NTI?Advance11綜合軟件包中的Contig?Express模塊對(duì)大菱鲆EST序列進(jìn)行聚類、拼接，再利用拼接后的EST重疊群通過(guò)人工判讀的方式篩查出候選C135TSNP位點(diǎn)，候選C135TSNP位點(diǎn)所在的基因序列為：

ACAAGCCTGGGGTCTACACTCGGGTCACTCACTTCCTGGACTGGATCAAATCAAAGACTCAAGCAACATTTCCATCAGCAACATGCCATGGTTAATAAGGGAGCTTTTGAATTTTGTGCAGATAAAACTGCTATCTGCTTTCAAGGCTATTTGATACTTACAAAAATGTAGTCATTGACTAAGCATTGTCACTTCAGTTTAACTGGATAAAGCATCACTGTCTGTGAACATTAAATAGCTCTCTGTTCTCCCAGTTATCTTTTTGTGTTAACACAGTTGCAAGCAATGATTGTTTGATGGATTCAAGTGCAAATGGGGAATAAAGGCGAAAACTTTGCTCACAT，其中加粗、加下劃線的堿基即為候選C135TSNP位點(diǎn)；