[發(fā)明專利]大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210066844.7
• 申請(qǐng)日: 2012-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN102534043A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬愛軍;劉慶明;黃智慧;王新安;楊志;曲江波;商曉梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京中偉智信專利商標(biāo)代理事務(wù)所 11325
• 代理人: 張岱

1.一種大菱鲆C135T單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的檢測方法，其特征在于它的方法包括：1)、基因組DNA提取；2)、候選SNP篩選；3)、引物、探針設(shè)計(jì)；4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；5)、探針雜交；6)、數(shù)據(jù)采集；7)、基因分型，具體步驟如下：

1)、基因組DNA提取：提取大菱鲆基因組DNA，將其稀釋為20ng/ul；

2)、候選SNP篩選：采用Vector?NTI?Advance11綜合軟件包中的Contig?Express模塊對(duì)大菱鲆EST序列進(jìn)行聚類、拼接，再利用拼接后的EST重疊群通過人工判讀的方式篩查出候選C135TSNP位點(diǎn)，候選C135TSNP位點(diǎn)所在的基因序列為：

ACAAGCCTGGGGTCTACACTCGGGTCACTCACTTCCTGGACTGGATCAAATCAAAGACTCAAGCAA?CATTTCCATCAGCAACATGCCATGGTTAATAAGGGAGCTTTTGAATTTTGTGCAGATAAAACTGCTATCTGCTTTCAAGGCTATTTGATACTTACAAAAATGTAGTCATTGACTAAGCATTGTCACTTCAGTTTA?ACTGGATAAAGCATCACTGTCTGTGAACATTAAATAGCTCTCTGTTCTCCCAGTTATCTTTTTGTGTT?AACACAGTTGCAAGCAATGATTGTTTGATGGATTCAAGTGCAAATGGGGAATAAAGGCGAAAACTTTG?CTCACAT，其中加粗、加下劃線的堿基即為候選C135TSNP位點(diǎn)；

3)、引物、探針設(shè)計(jì)：在候選C135TSNP位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)特異性引物，目的片段長度小于350bp，引物設(shè)計(jì)用Primer5.0，參數(shù)分析用Oligo7.0；根據(jù)候選C135TSNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’端封閉非標(biāo)記探針，探針的退火溫度范圍為60℃-80℃，探針3’端采用2堿基錯(cuò)配封閉，探針序列為5’-TTGAAAGCAGGATAGCAGTTTAG-3’；特異性引物正鏈為：5’-ACAAGCCTGGGGTCTACACTC-3’，負(fù)鏈為：5’-ATGTGAGCAAAGTTTTCGCCTT-3’，引物退火溫度56℃；

4)、不對(duì)稱PCR擴(kuò)增：使用候選C135TSNP對(duì)應(yīng)引物對(duì)步驟1所提取的大菱鲆基因組DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系為15ul，包括20ng/ul大菱鲆基因組DNA1ul，10×PCR?buffer1.5ul，2.5mMdNTPs各1.2ul，25mMMgCl₂1.2ul，5U/ul?Taq?DNApolymerase0.075ul，1×LC?Green?Plus1.5ul，10μM正鏈引物1.2ul，2μM負(fù)鏈引物1.2ul，加ddH₂O至15ul；設(shè)置PCR儀的程序?yàn)?5℃變性5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，60個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存；

5)、探針雜交：將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與3’端封閉的非標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交體系為每個(gè)不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系中加入10μM對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的3’端封閉的非標(biāo)記探針1.5ul；設(shè)置PCR儀的雜交程序：變性溫度95℃10min，之后自然降至室溫，置4℃保存；

6)、數(shù)據(jù)采集：將雜交產(chǎn)物置于Light?Scanner分析儀上進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集，采集曲線的溫度范圍為45℃至97℃，每攝氏度獲得10個(gè)點(diǎn)，升溫速度為0.1℃/s；

7)、基因分型：數(shù)據(jù)的檢索和分析運(yùn)用Light?Scanner分析軟件，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態(tài)性圖譜。