[發(fā)明專(zhuān)利]一種連續(xù)流動(dòng)巢式PCR微流控方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210066670.4
• 申請(qǐng)日: 2012-03-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102605065A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章春筍;邢達(dá);舒博文
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微流控PCR分析與檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種連續(xù)流動(dòng)巢式PCR微流控方法。

背景技術(shù)

自從20世紀(jì)90年代初?Manz?和?Widmer?首次提出微型全分析系統(tǒng)概念以來(lái)，作為其核心技術(shù)的微流控技術(shù)已發(fā)展為當(dāng)前世界上最前沿的科技領(lǐng)域之一。當(dāng)前微型全分析系統(tǒng)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在生命科學(xué)領(lǐng)域，微流控技術(shù)在促進(jìn)分析儀器微型化、集成化、自動(dòng)化和便攜化方面的優(yōu)勢(shì)為其在生物醫(yī)學(xué)、高通量藥物合成篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)與保護(hù)、衛(wèi)生檢疫、醫(yī)療保健診斷、法醫(yī)鑒定以及生化戰(zhàn)劑的偵測(cè)等眾多領(lǐng)域提供廣闊的應(yīng)用前景。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA片段的方法，因其優(yōu)異的靈敏度和特異性在生命科學(xué)以及諸多相關(guān)領(lǐng)域已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用。因此，在微流控技術(shù)日益朝生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的過(guò)程中，微流控技術(shù)與PCR相結(jié)合以實(shí)現(xiàn)快速靈敏的分析檢測(cè)是一種必然的發(fā)展趨勢(shì)。

目前微流控PCR主要分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩大類(lèi)。前者實(shí)質(zhì)為傳統(tǒng)PCR熱循環(huán)儀的微型化，由于微結(jié)構(gòu)本身仍具有較大的熱容而額外增加了變溫過(guò)程中的熱弛豫時(shí)間，因此PCR的快速性受到限制。后者利用“空間交換時(shí)間”讓PCR反應(yīng)液沿微通道連續(xù)通過(guò)兩或三個(gè)恒溫區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)PCR所需的熱循環(huán)，因此可快速變溫而大大縮短循環(huán)總時(shí)間。微通道結(jié)構(gòu)尺寸的縮小導(dǎo)致比面積大大增加，在提高導(dǎo)熱和傳質(zhì)速率從而加快分析和處理的同時(shí)，也使得通道內(nèi)壁與反應(yīng)液中的生物分子的相互作用加劇，降低PCR的擴(kuò)增效率，而動(dòng)態(tài)微流控PCR由于反應(yīng)液與通道接觸面積的增加而表現(xiàn)得更加明顯。為克服這些不足，一些新興技術(shù)和方法近年來(lái)得到發(fā)展，比如降低反應(yīng)通道與生物分子的相互作用而采用的通道內(nèi)表面鈍化處理、油包裹技術(shù)，但工藝流程復(fù)雜耗時(shí)，增加檢測(cè)成本，或樣品PCR后處理繁瑣，操作不便，難以滿足實(shí)際分析檢測(cè)中低成本高效率的需求。

在針對(duì)實(shí)際生物樣品核酸的檢測(cè)與分析中，采用現(xiàn)有技術(shù)方法的微流控PCR的成功運(yùn)用仍依賴于較高的初始核酸模板濃度，對(duì)于低豐度的核酸樣品則面臨檢測(cè)特異性和靈敏度不足的瓶頸。

巢式PCR作為一種利用兩套引物對(duì)進(jìn)行兩輪擴(kuò)增的改良的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其第一輪擴(kuò)增采用的外引物對(duì)與普通PCR相似，第二輪擴(kuò)增采用的內(nèi)引物可結(jié)合在第一輪擴(kuò)增DNA片段的內(nèi)部并且第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，因而降低了擴(kuò)增多靶點(diǎn)的可能性，有效增加低豐度核酸樣品的檢測(cè)特異性和靈敏度。另一方面，由于巢式PCR包含兩輪PCR擴(kuò)增，相比于常規(guī)PCR其耗時(shí)量倍增，特別是在傳統(tǒng)熱循環(huán)儀上巢式PCR通常需要2.5~4?h才能完成，導(dǎo)致檢測(cè)的時(shí)效性受到極大限制。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度核酸快速超靈敏檢測(cè)與分析，本發(fā)明的目的在于提供一種連續(xù)流動(dòng)巢式PCR微流控方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種連續(xù)流動(dòng)巢式PCR微流控方法，包括如下步驟：

1）提取待測(cè)樣本的基因組DNA；

2）引物設(shè)計(jì)：針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的特異性基因DNA序列設(shè)計(jì)由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物構(gòu)成的巢式引物；

3）配制PCR反應(yīng)體系：第一輪PCR反應(yīng)體系含有外引物；第二輪PCR反應(yīng)體系含有內(nèi)引物；

4）第一輪PCR反應(yīng)：將待測(cè)物的DNA樣品加入第一輪PCR反應(yīng)體系中，得到第一輪PCR反應(yīng)液，將第一輪PCR反應(yīng)液注入連續(xù)流動(dòng)巢式PCR微流控裝置中，完成20~35個(gè)PCR熱循環(huán)；

5）第二輪PCR反應(yīng)：取部分第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入第二輪PCR反應(yīng)體系中，充分混勻后，得到第二輪PCR反應(yīng)液，將第二輪PCR反應(yīng)液注入連續(xù)流動(dòng)巢式PCR微流控裝置中，完成20~35個(gè)PCR熱循環(huán)。

優(yōu)選的，第一輪PCR反應(yīng)體系包括：

組分???????????????????????????終濃度

?Taq?聚合酶????????????????0.05~0.1U/μL

?Tris-HCl（pH=8.3）????10?mM

?KCl???????????????????????????50?mM

?MgCl_{2????????????????????}??????????1.5?mM

?4×dNTP?Mixture???????0.2?mM

?外引物1???????????????????200~300?nM

?外引物2???????????????????200~300?nM

?第二輪PCR反應(yīng)體系包括：