[發明專利]一種連續流動巢式PCR微流控方法

無效

• 申請號: 201210066670.4
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102605065A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 章春筍;邢達;舒博文
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種連續流動巢式PCR微流控方法，包括如下步驟：

1）提取待測樣本的基因組DNA；

2）引物設計：針對目標檢測物的特異性基因DNA序列設計由一對外引物和一對內引物構成的巢式引物；

3）配制PCR反應體系：第一輪PCR反應體系含有外引物；第二輪PCR反應體系含有內引物；

4）第一輪PCR反應：將待測物的DNA樣品加入第一輪PCR反應體系中，得到第一輪PCR反應液，將第一輪PCR反應液注入連續流動巢式PCR微流控裝置中，完成20~35個PCR熱循環；

5）第二輪PCR反應：取部分第一輪PCR擴增產物加入第二輪PCR反應體系中，充分混勻后，得到第二輪PCR反應液，將第二輪PCR反應液注入連續流動巢式PCR微流控裝置中，完成20~35個PCR熱循環。

2.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：第一輪PCR反應體系包括：

組分???????????????????????????終濃度

Taq?聚合酶?????????????????0.05~0.1U/μL

Tris-HCl（pH=8.3）????10?mM

KCl????????????????????????????50?mM

MgCl_{2????????????????????}???????????1.5?mM

4×dNTP?Mixture????????0.2?mM

外引物1????????????????????200~300?nM

外引物2????????????????????200~300?nM

第二輪PCR反應體系包括：

組分???????????????????????????終濃度

Taq?聚合酶????????????????0.05~0.1?U/μL

Tris-HCl（pH=8.3）????10?mM

KCl????????????????????????????50?mM

MgCl_{2????????????????????}???????????1.5?mM

4×dNTP?Mixture????????0.2?mM

內引物1?????????????????????300~400?nM

內引物2?????????????????????300~400?nM。

3.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：第一輪PCR反應的條件為：20?~?35個PCR擴增循環，每個PCR擴增循環中，PCR反應液在解鏈恒溫區、退火恒溫區和延伸恒溫區的流通時間分別為4~10?s、4~10?s和4~22?s。

4.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：第二輪PCR反應的條件為：20?~?35個PCR擴增循環，每個PCR擴增循環中，PCR反應液在解鏈恒溫區、退火恒溫區和延伸恒溫區的流通時間分別為4?~?10?s、4?~15?s和10?~?22?s。

5.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR過程是在連續流動的單一液相體系中完成的。

6.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR的變性、退火和延伸是以PCR反應混合液反復依次流過解鏈恒溫區、退火恒溫區和延伸恒溫區的形式實現。

7.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR在解鏈恒溫區、退火恒溫區和延伸恒溫區的停留時間是通過調節PCR反應混合液在反應通道中線性流速來控制的。

8.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR在解鏈恒溫區、退火恒溫區和延伸恒溫區的停留時間之比是由反應通道在解鏈恒溫區、退火恒溫區和延伸恒溫區的長度之比決定。

9.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR反應體積可根據待測樣品的量在5~50?μL之間靈活可調。

10.根據權利要求1所述的連續流動巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR反應是在開放通道中單向流動過程中實現。