[發(fā)明專利]一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210066351.3
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102586455A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬俊松
• 申請（專利權(quán)）人: 萬俊松
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 謝德珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，具體為一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法（LAMP）基本原理，具備速度快、特異性強等優(yōu)點的基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素（Aflatoxin，簡寫AF）是一種真菌毒素，主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生，它影響機體的免疫系統(tǒng)、致突變、致畸、致癌，對動物體和人體健康造成嚴重威脅。我國最新的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對霉菌和毒素都做了嚴格要求。目前檢測黃曲霉毒素的方法有薄層層析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。但是，這些檢測霉菌的方法其處理方法均局限于傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法以及生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR），前者操作十分麻煩，時間需要4～7天，后者對儀器以及反應(yīng)條件比較高，檢測成本也相應(yīng)提升，難以做到較大規(guī)模推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，利用環(huán)媒恒溫基因擴增（LAMP）法檢測黃曲霉毒素真菌，可應(yīng)用于飼料、食品等的樣品檢測。

環(huán)媒恒溫基因擴增（Loop-mediated?isothermal?amplification，簡稱LAMP）是日本學(xué)者Notomi等于2000年發(fā)明的一種新的高效的恒溫基因擴增技術(shù)。該方法在恒溫條件（60?℃～65?℃）通過4條引物B3、F3、BIP和FIP識別目的基因的6個特異性區(qū)域，在Bst?DNA聚合酶的催化作用下擴增目的基因片段，反應(yīng)包括鏈置換反應(yīng)和環(huán)介導(dǎo)循環(huán)擴增兩個密切相關(guān)的環(huán)節(jié)。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，基于Ver-1基因建立LAMP法快速檢測黃曲霉素真菌，并應(yīng)用于飼料、食品的檢測；應(yīng)用ELISA法檢測樣品中AFB1毒素含量，并比較分析ELISA和LAMP檢測結(jié)果，其具體包括以下制備步驟：

1．制備PDA培養(yǎng)基：稱取去皮洗凈的馬鈴薯100?g，放入500?mL蒸餾水中，將水煮沸至100?℃并保持30分鐘，過濾，加入10?g瓊脂粉，補足水至1000?mL，調(diào)pH值至7.0，分裝后高壓滅菌，4?℃保溫貯存?zhèn)溆茫?/p>

2．培養(yǎng)菌種：將黃曲霉接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）上，28?℃培養(yǎng)；?

3．設(shè)置環(huán)媒恒溫基因擴增（LAMP）引物；

4．提取真菌DNA模板；

5．將模板、引物、dNTP和緩沖液等反應(yīng)試劑按比例配制加入PCR管，將反應(yīng)體系至于63?℃的溫度條件下保溫60?min，其后在80?℃下熱浴3分鐘滅活BstDNA聚合酶，反應(yīng)終止，產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳；

6．參考株DNA提取液作模板，采用25μL反應(yīng)體系。分別改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、Mg²⁺的濃度、dNTP的濃度、Betaine的濃度，分別進行LAMP反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳判斷LAMP結(jié)果，以選擇最好的擴增條件；

7．用LAMP?檢測法擴增黃曲霉，凝膠電泳成像檢查擴增產(chǎn)物，判斷該試驗的特異性；

8．以上制備的模板作10n倍比稀釋。分別取各稀釋度1?μL進行LAMP擴增。結(jié)合飼料中霉菌總數(shù)的測定方法(GB/T13092-2006)，以MPN法測定所挑取的菌液濃度；

9．按照上述方法建立黃曲霉素真菌檢測試劑盒；

在本發(fā)明中，凝膠用溴化乙錠染色，用以方便紫外線透射觀察。

在本發(fā)明中，所述黃曲霉素真菌檢測試劑盒可用SYBR?Green?I判斷法和凝膠電泳成像法判斷樣品檢測結(jié)果。

有益效果：本發(fā)明比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更快、更準(zhǔn)確。同時，LAMP法采用4條引物識別6個特異位點，保證了該方法高度特異性，同時，本發(fā)明還具備以下優(yōu)點：

1．本發(fā)明在檢測結(jié)果的方法上，充分利用LAMP的特殊優(yōu)勢，運用了傳統(tǒng)的凝膠成像檢測的同時，還利用SYBR?Green?I?實施可視化檢測。SYBR?Green?I實施可視化檢測避免了實際操作中EB帶來的污染，而且檢測的速度節(jié)約了40分鐘以上；

2．本發(fā)明檢測飼料中毒素真菌穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好。用該方法檢測了180飼料樣品，陽性率與ELISA方法吻合度高；

3．本發(fā)明中LAMP法檢測飼料中黃曲霉毒素真菌檢測成本不高，每個樣品只需要約3.0元。LAMP法所用到的Bst酶價格比傳統(tǒng)的Taq酶要貴，但本實驗中對該酶5倍稀釋后，一方面試驗結(jié)果穩(wěn)定，另一方面成本明顯降低，平均每個樣品的Bst酶只需要0.30元；