[發(fā)明專利]一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210066351.3
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102586455A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 萬俊松
• 申請（專利權）人: 萬俊松
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 謝德珍

1.一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，其特征在于，具體包括以下制備步驟：

1）制備PDA培養(yǎng)基：稱取去皮洗凈的馬鈴薯100?g，放入500?mL蒸餾水中，將水煮沸至100?℃并保持30分鐘，過濾，加入10?g瓊脂粉，補足水至1000?mL，調pH值至7.0，分裝后高壓滅菌，4?℃保溫貯存?zhèn)溆茫?/p>

2）培養(yǎng)菌種：將黃曲霉接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）上，28?℃培養(yǎng)；?

3）設置環(huán)媒恒溫基因擴增（LAMP）引物；

4）提取真菌DNA模板；

5）將模板、引物、dNTP和緩沖液等反應試劑按比例配制加入PCR管，將反應體系至于63?℃的溫度條件下保溫60?min，其后在80?℃下熱浴3分鐘滅活BstDNA聚合酶，反應終止，產物于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳；

6）參考株DNA提取液作模板，采用25μL反應體系，分別改變反應溫度、反應時間、Mg²⁺的濃度、dNTP的濃度、Betaine的濃度，分別進行LAMP反應，用瓊脂糖凝膠電泳判斷LAMP結果，以選擇最好的擴增條件；

7）用LAMP?檢測法擴增黃曲霉，凝膠電泳成像檢查擴增產物，判斷該試驗的特異性；

8）以上制備的模板作10n倍比稀釋，分別取各稀釋度1?μL進行LAMP擴增，結合飼料中霉菌總數(shù)的測定方法(GB/T13092-2006)，以MPN法測定所挑取的菌液濃度；

9）按照上述方法建立黃曲霉素真菌檢測試劑盒。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，其特征在于，所述凝膠用溴化乙錠染色，用以方便紫外線透射觀察。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于環(huán)媒恒溫基因擴增法的黃曲霉素檢測試劑盒，其特征在于，所述黃曲霉素真菌檢測試劑盒可用SYBR?Green?I判斷法和凝膠電泳成像法判斷樣品檢測結果。