[發明專利]轉基因玉米事件IE034外源插入片段旁側序列及其應用

有效

• 申請號: 201210065919.X
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102604940A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 王國英;劉允軍;張煜文;劉艷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及植物生物技術領域，具體地，涉及一種轉基因玉米IE034外源插入片段旁側序列以及用于檢測該序列的PCR引物，本發明還涉及利用該引物進行轉基因玉米檢測的方法和試劑盒。

背景技術

蟲害(尤其是玉米螟害)會造成玉米的嚴重減產，抗蟲轉基因玉米是世界上最早開展的研究性狀之一。抗蟲基因主要來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt殺蟲蛋白，其作用機理是使昆蟲胃腸產生穿孔，從而使昆蟲代謝紊亂而死亡。美國孟山都公司是轉基因抗蟲玉米研發與應用的領跑者，其開發的抗蟲轉基因玉米MON810和MON863都已經進入商品化生產多年。在MON810轉基因玉米中表達的Cry1Ab蛋白能有效防治玉米螟，在MON863中表達的Cry3Bb對危害玉米根部的害蟲有很好的防治效果。先正達公司也開發了表達Cry1Ab蛋白的轉基因抗蟲玉米BT11和BT176。先鋒公司和陶氏公司共同開發了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害蟲的轉基因玉米。我國在上世紀90年代初期就開展了轉基因抗蟲玉米的研究工作，丁群星等(1993)首次報道了用子房注射法將Bt毒蛋白基因導入玉米；王國英等(1995)用玉米懸浮細胞、愈傷組織和幼胚作受體，通過基因槍轟擊法成功地將Bt毒蛋白基因轉入玉米細胞，并獲得了大量轉基因植株；周逢勇等(1998)將Bt殺蟲蛋白導入玉米自交系P9-10，外源基因能穩定遺傳到轉基因植株后代。張艷貞等(2002)對根癌農桿菌介導法將Bt殺蟲基因導入優良玉米自交系進行了較為系統的研究。但相對于國外公司開發的抗蟲玉米，我國科學家得到的抗蟲玉米材料對玉米螟的抗性較低，需進一步得到大量轉化體并從中篩選到抗性優良的事件。

抗蟲轉基因玉米的商業化種植增加了玉米產量，降低了殺蟲劑等農藥的使用，帶來巨大的社會和經濟效益。但是，抗蟲玉米的長時間種植有可能使昆蟲對玉米螟產生抗性。研究發現，種植Bt176玉米地里的玉米螟滯育和滯育后發育延長，這些將加快昆蟲對Bt蛋白產生抗性(Christou等，2006)。延緩害蟲對轉Bt作物產生抗性的策略很多，比如高劑量/庇護所策略、新毒素策略、多基因策略等。最初高劑量/庇護所策略在農業生產中曾成功應用多年，但由于它需要大面積的庇護所，所以對于可用耕地相對匱乏的我國來說該策略還難以推廣。因此尋找新型Bt基因對減緩害蟲抗性產生具有重要意義。應對昆蟲產生抗性好的策略是向玉米中導入不同類型的殺蟲基因，或導入多個具有不同作用機制的同類基因。孟山都公司已經研制成功轉基因抗蟲玉米事件MON89034，在玉米中表達兩個相互補充的蛋白Cry2Ab和Cry1A.105，用于防治鱗翅目害蟲(James，2010)。孟山都公司和陶氏公司聯合開發出的具有更廣譜抗性轉基因玉米SmartStaxTM含有防治鱗翅目害蟲的Cry1F，Cry1a.105和Cry2Ab2基因，防治玉米根蟲的Cry34Ab1，Cry35Ab1和Cry3Bb1基因(Gatehous等，2008)。

Cry1Ie是中國農業科學院植物保護研究所發現一新型的Bt基因，能表達一種新型的Bt蛋白。我國科學家的研究結果表明通過多代篩選獲得的抗Cry1Ac蛋白的亞洲玉米螟系對Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性，而對Cry1Ie沒有交互抗性(韓海亮等，2009)，在煙草中共表達人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因對抗性棉鈴蟲有更好的殺蟲活性(練云等，2008)。這些結果表明在轉基因玉米中共表達Cry1Ac和Cry1Ie將有可能延緩玉米螟產生抗性。

我們將Cry1Ie基因通過農桿菌介導法轉入到玉米基因組中，獲得了一個抗蟲轉基因玉米事件IE034并在進行環境釋放階段的安全評價，今后有可能進入商業化種植。對轉基因玉米進行轉化事件特異性檢測，能更好的對轉基因玉米進行監督管理。而外源插入片段的旁側序列和依據此旁側序列建立的檢測方法，是進行監督管理的一個重要指標。因此需要獲得轉基因玉米IE034的旁側序列，并建立鑒定體系以備對此事件的監督管理。

發明內容

本發明的目的在于提供一種轉基因玉米事件IE034外源插入片段旁側序列以及用于檢測該序列的PCR引物。

本發明另一目的在于提供一種轉基因玉米的PCR檢測方法和試劑盒。

本發明的抗蟲轉基因玉米事件IE034按如下方式獲得：