[發明專利]一種基于固態納米孔對核酸分子進行減速及單分子捕獲的方法

有效

• 申請號: 201210065833.7
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102621214A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 趙清;魯鉑;俞大鵬
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種基于固態納米孔對核酸分子進行減速及單分子捕獲的方法。

背景技術

基于固態納米孔器件的DNA單分子探測分析被認為是最有希望實現第三代快速低成本人類基因測序(在24小時內花費1000美元以下實現單個人的基因組測序)的技術路線之一，成為目前研究和應用探索的熱點，除哈佛大學、波士頓大學、布朗大學、加州理工學院、荷蘭代爾夫特工業大學等研究小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測序-1000美元計劃，以基于納米孔器件的測序技術為實現方法，使納米孔的研究由基礎研究開始走向應用(D.Branton，et?al.Nature?Biotechnology?26(10)，1146(2008)；M.Zwolak?and?M.Di?Ventra，Reviews?of?Modem?Physics?80(1)，141(2008).)。通過在溶液中電泳驅動分子穿過一個納米尺度的孔可以實現基于納米孔器件的單分子探測和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過各種手段對大量分子進行快速的分析，當高聚物分子穿過納米孔時，高聚物分子的結構信息和探測的信號特征有一一對應關系。利用該特性可以直接對數千堿基對長度的單鏈DNA分子進行表征，避免了擴增或標記實驗準備環節，使得快速低成本DNA測序技術成為可能。目前阻礙這一技術長足發展的最大困難在于在電場驅動電壓下，DNA穿孔速度過快，超出了通用儀器的分辨率，從而無法實現對單堿基的差別進行識別。如何利用固態納米孔對DNA分子進行捕獲，對于研究溶液中對單分子的捕獲，操縱，控制，并且研究其化學轉化、分子內部動態變化等生物學過程具有非常重要的實際意義。

目前國際上較為常用的實驗技術是在納米孔兩端加一個電壓，通過電場驅動，使DNA分子從孔一端電泳通過納米孔，在外電路收集的離子電流會出現一個突然下降，電流的突然下降值和阻滯時間，可以對應DNA的生物學信息。但是單純使用電場調節，DNA的穿孔速度太快，基本在一個堿基一微秒的量級，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說，如果想要區別不同堿基之間的差別，通過現有手段，時間分辨率是無法達到的。要提高時間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時間延長，有效減慢DNA在孔中的運動速度。減慢DNA的穿孔速度，才有可能實現對不同堿基的分辨。美國Boston?College的Amit?Meller等人通過改變Cis和Trans腔填充的溶液鹽濃度，可以在5nm的SiN納米孔中，實現DNA分子毫秒量級的穿孔過程(M.Wanunu，W.Morrison，Y.Rabin，A.Y.Grosberg?and?A.Meller，Nature?Nanotechnology，5，160，(2010))。但是他們對產生這種現象的機理解釋不清楚，而且他們使用的納米孔很小，DNA與納米孔壁之間的相互作用可能會起作用，而這對實驗的可控性大打折扣。而且直徑很小的納米孔在實驗實現起來非常困難，成功率很低。

美國阿肯色大學的Jiali?Li等通過在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔時間，但是實驗條件要求非常苛刻，對實驗技術要求很高(D.Fologea，J.Uplinger，B.Thomas，D.S.McNabb，and?J.L.Li，Nano?Letters?5，1734(2005))。而且隨著甘油的增加，導致溶液粘滯系數增加，DNA穿孔阻滯電流值幅度下降，這樣測試的信噪比下降，導致測量誤差增大。另外可以通過降低電壓，使DNA穿孔速度減慢，但是電壓降低導致電流信號降低，信噪比變差，導致測量非常困難。可以看到現有的很多減慢DNA穿孔速度的做法都是在犧牲信噪比的基礎上才有可能實現，這樣對準確測量信號增加了很大難度，不容易得到準確相關的生物學信息。