[發明專利]一種葡萄糖脫氫酶的生產方法

有效

• 申請號: 201210065718.X
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102604904A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 陳令偉;周強強;武濤;劉毅
• 申請（專利權）人: 蘇州漢酶生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛;汪青

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用基因工程菌發酵生產葡萄糖脫氫酶的方法，主要用到微生物發酵方面的流加補料技術。

背景技術

葡萄糖脫氫酶（Glucose?dehydrogenase，縮寫GlcDH），是短鏈乙醇脫氫酶家族的一員，在輔酶NAD(P)⁺等存在時能夠催化β-D-葡萄糖轉化為葡萄糖酸。葡萄糖脫氫酶廣泛應用于催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸等方面，這些酶催化反應一般都需要輔酶NAD(P)H的參與，而這些輔酶價格昂貴，因此NAD(P)H的再生對于消減成本是非常必要的。美國施貴寶公司在利用白地霉脫氫酶不對稱還原4-氯-3-羰基丁酸甲酯合成(s)-4-氯-3-羥基丁酸甲酯的規模化生產中，有效地利用了葡萄糖脫氫酶進行輔酶NADP⁺-NADPH的循環，該反應的產率高達95%，產品為降膽固醇藥物的手性原料。

現有技術中，葡萄糖脫氫酶主要從動物的肝臟提取，或者由芽孢桿菌發酵而來，來源受到限制。而國內葡萄糖脫氫酶都主要依靠進口。由于葡萄糖脫氫酶具有廣泛的應用價值，市場需求量也日益增加，因此，開發一種廉價高效的葡萄糖脫氫酶的生產方法具有十分重要的現實意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中葡萄糖脫氫酶的來源受到限制而難以滿足市場需求的問題，提供一種利用基因工程菌發酵生產葡萄糖脫氫酶的方法。

為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案：

一種葡萄糖脫氫酶的生產方法，是先構建表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌并將其接種至初始培養基中進行發酵，發酵過程中通過流加補料技術向包含所述重組大腸桿菌的發酵液中添加補料培養基，當發酵參數達到設定閾值時，再向發酵液中添加誘導劑，并繼續發酵一定時間至發酵結束，最后從發酵液的培養物中取得葡萄糖脫氫酶；其中，流加補料時，補料培養基的流加速度隨著發酵時間的延長而梯度遞增，至添加誘導劑后保持不變。

流加補料技術是發酵過程中用來提高菌體濃度的一種傳統方法。這種方法能控制發酵時培養液中營養成分的濃度，因此在細胞生長或產物形成對底物濃度受限敏感的工藝過程中使用比較理想。

根據本發明，所述的發酵參數可以為發酵液的細胞光密度、發酵液中的溶氧或發酵液中的碳源總濃度等。

若未經特殊說明，本發明中所述的細胞光密度皆指的是OD₆₀₀值。OD₆₀₀是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。OD是optical?density（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度，是檢測方法里的專有名詞。光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。OD₆₀₀指的就是某種溶液在600nm波長處的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物質的濃度，相應地與樣品的透過率成反比。

本發明優選的一種生產方法，包括以下步驟：

（1）、準備階段：構建基因工程菌，配制種子培養基、初始培養基和補料培養基；使基因工程菌在所述種子培養基中活化，然后將活化后得到的種子液接種到初始培養基中進行發酵，按體積比，接種時種子液/初始培養基=1%~4%；所述基因工程菌為表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌；

（2）、發酵過程：本發明根據發酵進行的不同階段，細胞對培養液中營養成分的消耗速度不同，將發酵過程分為六個階段，并以培養液中的細胞光密度（OD₆₀₀）來劃分這六個階段，依次為第一階段0~4、第二階段4~8、第三階段8~12、第四階段12~16、第五階段16~20和第六階段OD₆₀₀＞20；