[發明專利]一種葡萄糖脫氫酶的生產方法

有效

• 申請號: 201210065718.X
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102604904A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 陳令偉;周強強;武濤;劉毅
• 申請（專利權）人: 蘇州漢酶生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛;汪青

1.一種葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：所述生產方法是先構建表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌并將其接種至初始培養基中進行發酵，發酵過程中通過流加補料技術向包含所述重組大腸桿菌的發酵液中添加補料培養基，當發酵參數達到設定閾值時，再向發酵液中添加誘導劑，并繼續發酵一定時間至發酵結束，最后從發酵液的培養物中取得葡萄糖脫氫酶；其中，流加補料時，補料培養基的流加速度隨著發酵時間的延長而梯度遞增，至添加誘導劑后保持不變。

2.根據權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：所述發酵參數為發酵液的細胞光密度、發酵液中的溶氧或發酵液中的碳源總濃度。

3.根據權利要求1所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：所述生產方法包括以下步驟：

（1）、準備階段：構建基因工程菌，配制種子培養基、初始培養基和補料培養基；使基因工程菌在所述種子培養基中活化，然后將活化后得到的種子液接種到初始培養基中進行發酵，按體積比，接種時種子液/初始培養基=1%~4%；所述基因工程菌為表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌；

（2）、發酵過程：當發酵液中的細胞光密度隨著發酵的進行依次達到4、8、12、16、20時，通過流加補料技術分批向發酵液中補充補料培養基，且補料培養基的流加速度依次對應為0~10g/l/h、10~20g/l/h、20~30g/l/h、30~40g/l/h、40~50g/l/h；當細胞光密度＞20時，向發酵液中添加誘導劑，且誘導劑在發酵液中的加入質量占發酵液總量的0.01%~0.2%；然后在保持補料培養基的流加速度不變的情況下繼續發酵16~20小時；

（3）、從步驟（2）所得發酵液的培養物中取得葡萄糖脫氫酶。

4.根據權利要求1或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：所述初始培養基包括蛋白胨6~15g/L、酵母粉5~10g/L、甘油6~18g/L、硫酸鎂1~4g/L、磷酸鹽4~8g/L和氯化鈉5~12g/L；所述補料培養基包括蛋白胨、酵母粉和甘油，且按質量計蛋白胨:酵母粉:甘油=2:1:14~15。

5.根據權利要求1或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：發酵過程中，發酵液的溶氧維持在30%~40%之間，發酵液pH值控制在6.8~7.3之間。

6.根據權利要求1或2?或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：所述誘導劑為異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

7.根據權利要求1或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：添加誘導劑前，發酵溫度控制在37℃；添加誘導劑后的發酵溫度控制在28℃。

8.根據權利要求3所述的葡萄糖脫氫酶的生產方法，其特征在于：步驟（1）中，所述種子培養基包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl?10g/L，且pH值為7.0。