[發明專利]一種運用核酸恒溫擴增技術檢測梅毒螺旋體的試劑和檢測方法

無效

• 申請號: 201210065229.4
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102618639A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 祁軍;劉振宇;李秀平;劉智勇;詹曦菁;劉啟軍;劉寅
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及病原體檢驗技術，具體地說是運用等溫擴增反應來檢測梅毒螺旋體的技術。

背景技術

梅毒螺旋體是所致的是一種廣泛流行的性病，在中國發病率又有所回升。梅毒螺旋體只感染人類，分獲得性梅毒與胎傳梅毒。獲得性梅毒主要通過性接觸傳染；胎傳梅毒由梅毒螺旋體通過胎盤，從臍帶血循環傳給胎兒，可引起胎兒全身感染。螺旋體在胎兒內臟及組織中大量繁殖，可引起胎兒死亡或流產。快速、準確的檢測梅毒螺旋體對治療和預防梅毒的蔓延有重大意義。隨著分子生物學的發展，檢驗檢疫工作中的微生物鑒定方法已經從傳統的簡單生化實驗水平上向分子生物學的方法如PCR、探針雜交等技術發展。最新開發出來的等溫擴增技術是一種更為高效的分子檢測方法，已經被很多國家認同，并大力發展。

發明內容

針對梅毒螺旋體，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用等溫擴增技術快速、便捷、低成本的檢測方法。

本發明提供了更加快速和低成本通過等溫擴增方法檢測梅毒螺旋體的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

(1)設計特異性寡核苷酸引物用于等溫擴增技術檢測；

(2)整合各引物使之不相互干擾。

(3)以引物序列組，擴增待測樣品模板，進行目的基因的特異性擴增；

(4)擴增完畢后可通過加入熒光染料SYBR?Green觀察顏色變化，或通過電泳帶形分析檢測結果。

該方法包括：應用該方法檢測梅毒螺旋體所使用的引物組和與之配套的等溫擴增反應條件。其中引物序列如下：

該引物序列參照GenBank中的序列CP001752?Treponema?pallidum?subsp.pallidum?str.Chicago，complete?genome中116730至117060堿基。

引物：

SEQ?ID?NO.1：

5’-CAGCACTCGTCTTCAACTCCTTGGTAGAAGGGAGGGCT

SEQ?ID?NO.2：

5’-GAGATCTTAGGCAGGATGTTATTCTACAGGGTCAGTAA

SEQ?ID?NO.3：5’-TGACAGAGTCTTCTGTGCTCACG

SEQ?ID?NO.4：5’-ACACCATTCGCACACGCGCAAT

SEQ?ID?NO.5：5’-GAGGTGAACTCCGTATT

SEQ?ID?NO.6：5’-AATGACCTGCACTGCGTG。

本發明用特異性的引物組擴增梅毒螺旋體，反應后目測結果和電泳結果均未發現假陽性和假陰性的結果。

本發明中反應體系中各組分構成比例如下：

其中Bst酶緩沖液的成分為20mM?Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM?KCl、2mM?MgSO4、質量百分比0.1％Triton?X-100、10mM?dNTP，且pH為8.8。等溫擴增程序為：

(1)63℃???????90分鐘；

(2)80℃???????2分鐘。

等溫擴增產物可通過兩種方法檢測：

(1)將反應液中加入SYBR?Green染料，陽性結果呈綠色，陰性結果為棕黃色。

(2)吸取2μL反應液在含SYBR?Green染料的1％濃度(W/V)的瓊脂糖凝膠中電泳，可見陽性結果有呈階梯狀排列的電泳條帶，陰性結果則沒有。

如出現其它結果則表明此次檢驗失敗不能確定是否存在梅毒螺旋體，需重新檢驗。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：相比傳統生理生化檢測方法，基于等溫擴增的鑒定方法適用于直接從臨床樣品中擴增靶基因，只需要一次等溫擴增反應就能夠檢測梅毒螺旋體是否存在，大大提高了效率節約了時間。相比較其它PCR方法，本方法制僅需要簡單的設備——一個恒溫水域、一個離心機或普通電泳設備即可，大大提高了性價比節約了成本。等溫擴增方法具有檢測準確、特異性強、靈敏度高的特點，可以快速、準確地鑒定特異的目的病原體。它通過擴增靶基因，避免了反復培養，節約時間；該鑒定方法不受培養條件和病原體生理狀態的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。

附圖說明