[發(fā)明專利]導(dǎo)入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210065114.5
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102559733A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曲曉軍;崔艷華;張超;孫建華;夏海華;王金英;于沖
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所;哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種導(dǎo)入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)是一種人畜共患病的重要致病菌，并且是毒力最強(qiáng)的致病菌。其可引起局部化膿感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒血癥等全身感染。同時，金黃色葡萄球菌也是國內(nèi)外最常見的細(xì)菌性食物中毒病原之一。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希氏菌，居第二位，占細(xì)菌性食物中毒的33％。在我國，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒約占細(xì)菌性食物中毒事件的25％，而在美國、加拿大等發(fā)達(dá)國家，更是高達(dá)50％。美國每年因被金黃色葡萄球菌感染而喪生的人數(shù)已超過死于艾滋病人數(shù)。因此，金黃色葡萄球菌的防治具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義及經(jīng)濟(jì)意義。

近年來，隨著對金黃色葡萄球菌致病機(jī)理研究的不斷深入，人們認(rèn)識到，細(xì)菌感染的第一步就是在體內(nèi)定殖，而實(shí)現(xiàn)定殖的前提是細(xì)菌黏附在宿主的組織表面。這也就要求細(xì)菌有可以黏附到組織表面的組分，即黏附素。從20世紀(jì)開始，國外的研究學(xué)者對金黃色葡萄球菌的黏附素進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌主要黏附素——纖黏蛋白原凝集素A(ClfA)，ClfA主要黏附于纖維蛋白原和纖維蛋白上，與乳腺、皮下、血管、心內(nèi)膜等的感染有關(guān)。迄今為止，所有臨床分離的金黃色葡萄球菌中都存在編碼ClfA的基因clfA。

對金黃色葡萄球菌黏附素表達(dá)調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)，在金黃色葡萄球菌感染的早期主要表達(dá)黏附素，之后才表達(dá)毒素和莢膜，所以，對金黃色葡萄球菌的黏附進(jìn)行干預(yù)，可以減少或阻止毒素和莢膜的表達(dá)，而以黏附素作為靶位進(jìn)行疫苗研制可能是預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的有效途徑。

目前已有學(xué)者用大腸桿菌表達(dá)金黃色葡萄球菌clfA基因，為下一步研制基因工程疫苗奠定了研究基礎(chǔ)。但是以其作為載體研制的疫苗存在著可能保持侵襲性和毒性的問題，在應(yīng)用于兒童、老人和免疫缺陷者時受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決目前使用大腸桿菌作為宿主表達(dá)clfA基因，研制基因工程疫苗存在侵襲性和毒性問題，提供導(dǎo)入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構(gòu)建方法。

本發(fā)明導(dǎo)入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行：一、提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA；二、以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，以MG-CLaF和MG-CLaR2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，獲得clfA基因；四、采用質(zhì)粒提取試劑盒提取保存于大腸桿菌JM109中的質(zhì)粒pMG36c；五、分別對clfA基因和質(zhì)粒pMG36c進(jìn)行雙酶切，將酶切后的clfA基因和質(zhì)粒pMG36c用連接試劑盒進(jìn)行連接，得連接產(chǎn)物；六、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，采用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，完成重組質(zhì)粒pMG36c-ClfA的構(gòu)建；七、將重組質(zhì)粒pMG36c-ClfA電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，即完成導(dǎo)入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構(gòu)建；其中步驟一中PCR引物MG-CLaF的序列為5′-GCGGTCGACATGAATATGAAGAAAAAAG-3′，引物MG-CLaR2的序列為5′-TTACCCGGGCAACCTACCTTACACCCT-3′。

本發(fā)明以乳酸乳球菌作為載體表達(dá)clfA基因，可用于研制基因工程疫苗，安全、無致病性。基因工程疫苗以其作為載體，可避免用病原菌作為宿主的活菌疫苗存在的侵襲性和毒性問題，這有利于在兒童、老人和免疫缺陷者中應(yīng)用。

以大腸桿菌作為宿主表達(dá)clfA基因，研制的疫苗存在著可能保持侵襲性和毒性的問題，在應(yīng)用于兒童、老人和免疫缺陷者時受到了限制。而乳酸乳球菌是公認(rèn)的食品級安全微生物，以其作為載體表達(dá)clfA基因而構(gòu)建的疫苗，具有比大腸桿菌所不具有的優(yōu)勢。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。