[發明專利]導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建方法

無效

• 申請號: 201210065114.5
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102559733A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 曲曉軍;崔艷華;張超;孫建華;夏海華;王金英;于沖
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所;哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

1.導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建方法，其特征在于導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行：一、提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA；二、以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，以MG-CLaF和MG-CLaR2為引物，進行PCR擴增；三、將PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得clfA基因；四、采用質粒提取試劑盒提取保存于大腸桿菌JM109中的質粒pMG36c；五、分別對clfA基因和質粒pMG36c進行雙酶切，將酶切后的clfA基因和質粒pMG36c用連接試劑盒進行連接，得連接產物；六、將連接產物轉化到大腸桿菌JM109感受態細胞中，采用氯霉素篩選轉化子，完成重組質粒pMG36c-ClfA的構建；七、將重組質粒pMG36c-ClfA電轉化乳酸乳球菌MG1363，即完成導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建；其中步驟一中PCR引物MG-CLaF的序列為5′-GCGGTCGACATGAATATGAAGAAAAAAG-3′，引物MG-CLaR2的序列為5′-TTACCCGGGCAACCTACCTTACACCCT-3′。

2.根據權利要求1所述的導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中PCR擴增的反應體系為20μL反應體系，由下列成分組成：

PCR擴增條件為：94℃變性2min，94℃變性15s，58℃退火30s，68℃延伸90s，共35個循環，再68℃延伸5min，4℃保溫。

3.根據權利要求1所述的導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟五中clfA基因雙酶切的體系如下：

酶切反應條件：37℃水浴，1h。

4.根據權利要求1所述的導入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟五中質粒pMG36c雙酶切的體系如下：

酶切反應條件：37℃水浴，1h。