[發(fā)明專利]制備和構(gòu)建抗各種已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗體庫的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210064594.3
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102618939A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王勝軍
• 申請（專利權(quán)）人: 王勝軍
• 主分類號: C40B40/10
• 分類號: C40B40/10;C40B50/06;C07K16/28;C07K16/06
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1.一種制備和構(gòu)建抗各種已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗體庫的方法，其特征在于整個實驗方案：包括第一階段和第二階段兩個主要實驗步驟。

第一階段主要實驗步驟：

(1).通過四種不同試驗途徑制備全方位抗人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位抗體(Ab1抗體)：

一方面①.應(yīng)用不同來源保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞和相應(yīng)腫瘤細(xì)胞(包括相應(yīng)永生化細(xì)胞)，分別免疫大量不同品系(注：包括雜交和野生)的兔子和鼠，從中分別提取兔子和鼠的抗人血清和其純化的總抗體。然后應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞分別與這些抗人血清和其純化的總抗體相互作用，接著以人呼吸道上皮細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人呼吸道上皮細(xì)胞抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人呼吸道上皮細(xì)胞的抗體稱Ab1抗體。②.制備大量不同品系(注：包括雜交和野生)未經(jīng)免疫的兔子和鼠以及羊等動物血清和從這些動物血清中提取純化的總抗體。然后應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞分別與這些未經(jīng)免疫的兔子和鼠以及羊等動物血清和其純化的總抗體相互作用，接著以人呼吸道上皮細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人呼吸道上皮細(xì)胞抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人呼吸道上皮細(xì)胞的抗體稱Ab1抗體。③.應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)試驗技術(shù)，從不同品系牛和羊乳汁中提取純化總抗體。然后應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞分別與這些從不同品系牛和羊乳汁中提取純化的總抗體相互作用，接著以人呼吸道上皮細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人呼吸道上皮細(xì)胞抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人呼吸道上皮細(xì)胞的抗體稱Ab1抗體。④由于這是一條十分特殊的試驗途徑因此單獨闡述：即通過說明書2.1.2途徑可得到萬人體內(nèi)全部不同克隆的抗體。首先應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞與上述商品化的全部人免疫球蛋白相互作用，并通過常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，提取并純化吸附在人呼吸道上皮細(xì)胞的低親和性和多反應(yīng)性的天然自身抗體(NAA)，即少量的具有天然免疫耐受性質(zhì)的Ab1抗體。同時全部回收(收集并保留)那些不與上皮細(xì)胞相結(jié)合的全部人免疫球蛋白。然后再用相應(yīng)腫瘤細(xì)胞與那些不與上皮細(xì)胞結(jié)合的全部人免疫球蛋白相互作用，從中篩選特異性抗癌抗體。并在吸附特異性抗癌抗體后，最后千萬注意再次全部回收和儲存那些不與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合的全部人免疫球蛋白以備制備本發(fā)明所需的Ab2β抗體。

本發(fā)明通過上述四種途徑---制備全方位抗人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗體(本發(fā)明稱原始Ab1抗體，借以區(qū)別第二階段的人工“Ab1抗體庫”)。。

另一方面上述試驗衍生的附加產(chǎn)品-----特異性抗相應(yīng)人肺腫瘤細(xì)胞Ab1抗癌抗體的獲得。特別重點指出：本發(fā)明在該階段試驗中存在著毫不費力的附加產(chǎn)品(抗癌領(lǐng)域方面)-----即應(yīng)用不同來源保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞完全徹底吸附上述四種途徑制備Ab1抗體的試驗后，再應(yīng)用相應(yīng)人肺腫瘤細(xì)胞分別與全部回收(收集并保留)沒有結(jié)合上皮細(xì)胞后所剩下的其它全部抗體相互作用。，接著以相應(yīng)人肺腫瘤細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人肺腫瘤細(xì)胞抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人肺腫瘤細(xì)胞抗體，稱特異性Ab1抗癌抗體。有充分理論依據(jù)說明：本發(fā)明已經(jīng)是盡可能最大限度集中人和動物眾群體免疫系統(tǒng)的綜合力量，并以求獲得最大程度免疫識別廣度和深度的優(yōu)勢效應(yīng)，即眾多不同的“自我”與“非我”免疫識別體系，以此克服個體免疫識別盲區(qū)(如有充分理論依據(jù)說明鼠源單克隆抗體免疫識別能力十分有限，而且由于遺傳因素影響每一個體淋巴細(xì)胞庫的庫容量都是既有限度又有差異，另外個體免疫系統(tǒng)胚胎發(fā)育期因先天免疫耐受造成T細(xì)胞庫和B細(xì)胞庫漏洞……等眾多原因)，用以識別人呼吸道上皮細(xì)胞與相應(yīng)腫瘤細(xì)胞之間的微細(xì)差異(注：這本身就是辯證思維相對論指導(dǎo)下事物兩面性和整體與局部相互作用的大局觀念)。因此通過本階段該方法獲得的抗癌抗體比之目前任何方法獲得的抗癌抗體在精準(zhǔn)性識別腫瘤細(xì)胞方面都會更加可靠和更具有可行性。(注：一般規(guī)律是應(yīng)用同一個體具有共同起源的人呼吸道上皮細(xì)胞和相應(yīng)人腫瘤細(xì)胞從事上述試驗的，這種試驗準(zhǔn)確度高。如同一個體肺癌手術(shù)切除術(shù)后，分離被切除腫瘤組織中的新鮮正常細(xì)胞和新鮮腫瘤細(xì)胞)

(2).全方位模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位抗體(Ab2β抗體)的制備：

一方面①.首先通過以下三種不同途徑，分別獲得大量不同來源的不同人群的不同個體和不同種系的不同動物(注：包括雜交和野生)以及其它不同來源的總抗體。第一途徑：應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，分別提取純化大量不同人血清和不同品系(注：包括雜交和野生)兔子、鼠、羊等動物血清中的總抗體。第二途徑：應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，分別從牛和羊或人乳汁中提取純化總抗體。第三途徑：購買正規(guī)市場各種不同來源的商品化人體免疫球蛋白，即通過(1)……④……途徑全部回收(收集并儲存)那些不與人呼吸道上皮細(xì)胞和相應(yīng)腫瘤細(xì)胞相結(jié)合的所有剩下的全部人免疫球蛋白，這才是本發(fā)明制備人源性Ab2β抗體所需總抗體的最佳途徑。本發(fā)明通過上述三種途徑可分別獲得大量不同來源未經(jīng)免疫的人和動物的總抗體(注：內(nèi)含潛在的本發(fā)明所需的“Ab2β抗體”)。②專一篩選結(jié)合Ab1抗體抗原結(jié)合位點的Ab2β抗體：首先通過本發(fā)明十分簡單的獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，分別巧妙處理第一階段(2)……①……通過上述三種途徑獲得大量不同來源未經(jīng)免疫的人和動物的總抗體(注：內(nèi)含潛在的本發(fā)明所需的Ab2β抗體)與第一階段(1)……制備的全方位抗人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗體，關(guān)鍵在于解決兩者之間相互作用關(guān)系問題。即通過本發(fā)明獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，分別從第一階段(2)……①……經(jīng)三種途徑獲得的大量不同來源未經(jīng)免疫的人和動物總抗體中，完全徹底清除掉與全部Ab1抗體本身的抗原結(jié)合部位不能結(jié)合的任何無關(guān)的抗體，辯證思維就是指完全徹底清除掉那些專門與Ab1抗體(非抗原結(jié)合部位)本身其它表位相結(jié)合的抗體。經(jīng)過本發(fā)明這種獨創(chuàng)性特殊篩選技術(shù)和過程，唯一目的是全部回收(收集和儲存)其它與本發(fā)明相關(guān)的抗體(注：內(nèi)含潛在的本發(fā)明所需的Ab2β抗體)。然后應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)如免疫親和純化技術(shù)：第一步，將純化的Ab1抗體與固相基質(zhì)共價連接，制備Ab1抗體親和層析柱。第二步，在(2)……①和②……試驗過程，即已經(jīng)完全徹底清除掉與Ab1抗體(非抗原結(jié)合部位)的本身其它表位相結(jié)合的無關(guān)抗體后，把全部回收(收集和儲存)的其它與本發(fā)明相關(guān)的總抗體，分別與Ab1抗體親和層析柱相互作用，唯一目標(biāo)是特異性篩選結(jié)合到Ab1抗體本身的抗原結(jié)合部位的抗體，即本發(fā)明所需的Ab2β抗體。第三步，從層析柱上洗脫Ab2β抗體。如此經(jīng)過免疫親和純化技術(shù)，分別提取純化來自人源和動物源的不同的Ab2β抗體。

另一方面上述試驗衍生的附加產(chǎn)品-------模擬人相應(yīng)肺腫瘤細(xì)胞膜表面特有抗原表位抗體(Ab2β抗體)的獲得，整個試驗過程和應(yīng)用技術(shù)完全同第一階段(2).全方位模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位抗體(Ab2β抗體)的制備試驗過程和應(yīng)用技術(shù)，因此不再重復(fù)闡述。制備的模擬人相應(yīng)肺腫瘤細(xì)胞膜表面特有抗原表位的Ab2β抗體，同樣可通過下面第二階段主要實驗步驟的整個試驗過程和應(yīng)用技術(shù)，獲得“Ab1抗癌抗體”產(chǎn)生細(xì)胞。并可通過轉(zhuǎn)基因動物或通過細(xì)胞工程抗體技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)制備工程抗癌抗體，最終走向工程抗癌抗體產(chǎn)業(yè)化之路。由于本發(fā)明目標(biāo)和實驗方案時間有限，故對抗癌抗體的制備在此簡單陳述，并在第二階段主要實驗步驟不再闡述這種附加產(chǎn)品。

(3)競爭抑制試驗

應(yīng)用各種常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)：根據(jù)競爭抑制試驗，觀察Ab2β抗體競爭抑制人呼吸道上皮細(xì)胞與Ab1抗體結(jié)合的能力，特別是能否全方位阻斷人呼吸道上皮細(xì)胞與Ab1抗體的結(jié)合能力(同時設(shè)置人呼吸道上皮細(xì)胞與Ab1抗體結(jié)合的對照組)，以此判斷本發(fā)明全方位模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的Ab2β抗體是否還存在“克隆漏洞”，本發(fā)明可完全通過簡單的特異性試驗彌補(bǔ)這種“克隆漏洞”。

(4).檢測Ab2β抗體與引起普通感冒的各種病毒和流感疫苗相互作用

經(jīng)過(2).全方位模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位抗體(Ab2β抗體)的制備：過程，獲得的全部Ab2β抗體，其實質(zhì)就是一個簡單的、不同的、初級的Ab2β抗體庫?？梢钥隙ù穗A段盡管抗體庫中每一單個克隆的抗體數(shù)量不會很多，但足以應(yīng)對試驗所需。

本發(fā)明從安全角度出發(fā)，通過常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，檢測Ab2β抗體與引起普通感冒的各種病毒和流感減毒活疫苗以及滅活疫苗相互作用。即通過不同技術(shù)手段檢測Ab2β抗體與病毒和疫苗特異性結(jié)合的功能和效果。確證試驗成功的最重要標(biāo)志是：“Ab2β抗體庫”與各種引發(fā)普通感冒的病毒和各種流感特定疫苗特異性結(jié)合的范圍越廣說明成功率越高(設(shè)置巧妙的試驗對照組)，同時說明本發(fā)明“Ab2β抗體庫”構(gòu)建越完善。如果與上述病毒和疫苗特異性結(jié)合的成功率達(dá)到百分之百，則意味著本發(fā)明“Ab2β抗體庫”與未知和變異的致命性呼吸道病毒特異性結(jié)合的成功率也會極高。當(dāng)然本發(fā)明“Ab2β抗體庫”會進(jìn).一步完善。

(5).Ab2β抗體與引起普通感冒的特定病毒中和試驗

如果針對某一特定病毒的特異性Ab2β抗體數(shù)量足夠多的話，或者通過“追蹤溯源”再次提取純化該抗體，以便進(jìn)行相應(yīng)病毒中和試驗。

(6).確證試驗證實本發(fā)明篩選到特異性抗病毒抗體，表明第一階段(時間3-6個月)試驗成功結(jié)束。

(7)預(yù)期產(chǎn)品：

①制備具有不同功能和用途的全部原始Ab1抗體和相對應(yīng)的全部原始Ab2β抗體。

②本實驗方案可毫不費力的極可能同時獲得抗相應(yīng)人肺腫瘤細(xì)胞的特異性抗癌抗體。

(8).立即向世界各大國申請發(fā)明專利，在全世界控制實驗方法和主要技術(shù)及場......第二階段主要實驗步驟：

(1).制備和構(gòu)建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗體庫”：

①.專一篩選能夠結(jié)合Ab2β抗體本身抗原結(jié)合位點的B細(xì)胞：

第一步試驗：首先應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，分別提取純化大量不同品系(注：包括雜交和野生)兔子、鼠、羊等動物的B細(xì)胞-------主要是未經(jīng)過免疫的B細(xì)胞和第一階段經(jīng)過多次免疫后純化并儲存的兔子及鼠的B細(xì)胞，其中包括不同器官組織來源及不同途徑來源的B細(xì)胞。第二步試驗：通過本發(fā)明十分簡單的獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，分別巧妙處理上述第一步試驗獲得的兔子、鼠、羊等動物的B細(xì)胞和第一階段獲得的全部Ab2β抗體，關(guān)鍵在于解決B細(xì)胞和Ab2β抗體兩者之間相互作用關(guān)系問題。即通過本發(fā)明獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，從這些B細(xì)胞中完全徹底清除掉與全部Ab2β抗體本身的抗原結(jié)合部位不能結(jié)合的任何無關(guān)的B細(xì)胞，辯證思維就是指完全徹底清除掉那些專門與Ab2β抗體(非抗原結(jié)合部位)本身其它表位相結(jié)合的B細(xì)胞。經(jīng)過本發(fā)明這種獨創(chuàng)性特殊篩選技術(shù)和過程，唯一目的是全部回收(收集和保留)所有剩下的其它與本發(fā)明相關(guān)的B細(xì)胞(注：內(nèi)含潛在的本發(fā)明所需的Ab1抗體產(chǎn)生細(xì)胞)。第三步試驗：即將第二步試驗……全部回收(收集和保留)所有剩下的其它與本發(fā)明相關(guān)的B細(xì)胞并和全部Ab2β抗體分別分類進(jìn)行相互作用，再通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)或結(jié)合免疫磁性微珠技術(shù)，可更多更快的篩選出專一結(jié)合Ab2β抗體本身的抗原結(jié)合部位的特異性B細(xì)胞，即本發(fā)明所需的Ab1抗體產(chǎn)生細(xì)胞。

②.制備和構(gòu)建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗體庫”的方法和技術(shù)：

首先將能夠與Ab2β抗體本身的抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合的B細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)并在不同刺激條件下，在特定的不同時間內(nèi)，通過兩條途徑：第一途徑，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞(增值為目的)，通過構(gòu)建噬菌體抗體庫技術(shù)的兩種不同方式：其一為主要方式，即B細(xì)胞內(nèi)PCR(In-CellPCR)裝配技術(shù)--噬菌體抗體庫技術(shù)，以保證抗體的輕重鏈配對為體內(nèi)原始配對的前提下，制備噬菌體Ab1抗體(注：本發(fā)明不排除伴隨細(xì)胞內(nèi)PCR(In-CellPCR)技術(shù)--噬菌體抗體庫技術(shù)的不斷進(jìn)步，解決經(jīng)多次免疫產(chǎn)生的千差萬別不同克隆的記憶性B細(xì)胞，最重要“通用引物”設(shè)計的困難問題，制備輕重鏈配對為體內(nèi)原始配對的噬菌體Ab1抗體)。其二，即通常的構(gòu)建噬菌體抗體庫技術(shù)，，盡管這種方式獲得的抗體基因是體外的隨機(jī)組合。但由于抗體和抗原結(jié)合的特異性常主要由VH決定，所以本發(fā)明全部特異性B細(xì)胞(Ab1抗體產(chǎn)生細(xì)胞)可在不改變特異性的情況下，使其每一個特異性的VH與本發(fā)明特異性B細(xì)胞不同的VL進(jìn)行組合(鏈替換)，產(chǎn)生特異性相同而親和力不同的Ab1抗體(注：不排除某些VH與VL因空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性差和穩(wěn)定性差等原因?qū)е屡鋵κ?。因此本發(fā)明可在不改變每一個B細(xì)胞克隆特異性的情況下找到VH---VL最佳配對，反而更可能篩選到高親和力的Ab1抗體?；蛟S由于類似免疫抗體庫的原因，但本發(fā)明比免疫抗體庫更具優(yōu)越性和保障性，即全部由特異性B細(xì)胞克隆組成，如果數(shù)量足夠大而且VH---VL互補(bǔ)性強(qiáng)空間結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，這會使原始抗體輕鏈和重鏈配對極易被恢復(fù)，反而不會導(dǎo)致高親和力原始Ab1抗體丟失。本發(fā)明通過這兩種不同方式(注：關(guān)注通用引物和簡并引物使用的方法)制備噬菌體“Ab1抗體庫”(注：需要和具體試驗操作者協(xié)商，選擇最適合本發(fā)明的方法和技術(shù))。第二途徑根據(jù)用途不同：其一，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞(生產(chǎn)抗體為目的)，通過轉(zhuǎn)化為抗體分泌漿細(xì)胞，獲得分泌性Ab1抗體(該途徑雖獲得的每一單個克隆抗體的數(shù)量較少，但足夠試驗所用)，制備原始特異性“Ab1抗體庫”。其二，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞(增值為目的)，作為抗原儲存(注：每個B細(xì)胞膜表面有1萬-10萬個BCR抗原分子，而且BCR排列方向一致都易接近，區(qū)別抗體作為免疫原)以備免疫不同品系兔子和鼠制備Ab2β抗體和獲取Ab2β抗體產(chǎn)生細(xì)胞。

通過這兩條途徑盡可能獲得抗人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的全部“Ab1抗體”，并以此制備和構(gòu)建初級具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗體庫”：

(2).構(gòu)建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗體庫”

①.專一篩選能夠結(jié)合Ab1抗體抗原結(jié)合位點的B細(xì)胞：

第一步試驗：首先應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，分別提取純化大量不同人和不同品系(注：包括雜交和野生)兔子以及鼠的B細(xì)胞(包括未經(jīng)過免疫和經(jīng)過免疫的不同器官組織來源及不同途徑來源的B細(xì)胞)。其中含有第二階段(1)……②……其二，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞(增值為目的)，作為抗原(注：每個B細(xì)胞膜表面有1萬-10萬個BCR抗原分子，而且BCR排列方向一致都易接近，區(qū)別抗體作為免疫原)免疫不同品系兔子和鼠，并提取純化經(jīng)過免疫的B細(xì)胞(注：其免疫血清內(nèi)含相應(yīng)Ab2β抗體，可通過第一階段制備的特異性Ab1抗體篩選出來，制備原始Ab2β抗體)。另外本試驗重復(fù)指出：通過說明書2.1實驗主要材料2.1.1途徑……可獲得內(nèi)含專一針對和模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的特異性B細(xì)胞可達(dá)幾十萬至百萬不同克隆，而且已注意到B細(xì)胞和抗原都會出現(xiàn)重復(fù)計算。其中必然會得到本發(fā)明所需的全部模擬各種已知和未知或變異的呼吸道上皮細(xì)胞表面病毒受體(如呼吸道以有包膜病毒為主，其受體表達(dá)十分豐富)的，具有較高親和力的眾多不同克隆的Ab2β抗體，這是本發(fā)明構(gòu)建人源性“Ab2β抗體庫”的最佳途徑。第二步試驗：通過本發(fā)明十分簡單的獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，分別巧妙處理第一步試驗獲得的人和兔子以及鼠的B細(xì)胞與第一階段獲得的全部Ab1抗體，關(guān)鍵在于解決B細(xì)胞與Ab1抗體兩者之間相互作用關(guān)系問題。即通過本發(fā)明獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，從這些B細(xì)胞中完全徹底清除掉與Ab1抗體本身的抗原結(jié)合部位不能結(jié)合的任何無關(guān)的B細(xì)胞，辯證思維就是指完全徹底清除掉那些專門與Ab1抗體(非抗原結(jié)合部位)本身其它表位相結(jié)合的B細(xì)胞。經(jīng)過本發(fā)明這種獨創(chuàng)性特殊篩選技術(shù)和過程，唯一目的是全部回收(收集和保留)所有剩余的其它與本發(fā)明相關(guān)的B細(xì)胞(注：內(nèi)含潛在的本發(fā)明所需的Ab2β抗體產(chǎn)生細(xì)胞)。第三步試驗：.即將第二步試驗……全部回收(收集和儲存)所有剩余的與本發(fā)明相關(guān)的B細(xì)胞并和全部Ab1抗體分別分類進(jìn)行相互作用，再通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)或結(jié)合免疫磁性微珠技術(shù)，可更多更快的篩選出專一結(jié)合Ab1抗體本身的抗原結(jié)合部位的特異性B細(xì)胞，即本發(fā)明所需的Ab2β抗體產(chǎn)生細(xì)胞。

②制備和構(gòu)建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗體庫”的方法和技術(shù)：

首先將能夠與Ab1抗體本身的抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合的B細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)并在不同刺激條件下，在特定的不同時間內(nèi)，通過兩條途徑：第一條途徑，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞(增值為目的)，通過構(gòu)建噬菌體抗體庫技術(shù)的兩種不同方式：其一為主要方式，即通過B細(xì)胞內(nèi)PCR(In-CellPCR)裝配技術(shù)--噬菌體抗體庫技術(shù)，以保證抗體的輕重鏈配對為體內(nèi)原始配對的前提下，制備噬菌體“Ab2β抗體庫”(注：本發(fā)明不排除伴隨細(xì)胞內(nèi)PCR(In-CellPCR)技術(shù)--噬菌體抗體庫技術(shù)的不斷進(jìn)步，解決經(jīng)多次免疫產(chǎn)生的千差萬別不同克隆的記憶性B細(xì)胞，最重要“通用引物”設(shè)計的困難問題，制備輕重鏈配對為體內(nèi)原始配對的噬菌體Ab2β抗體)。其二，即通常的構(gòu)建噬菌體抗體庫技術(shù)，，盡管這種方式獲得的抗體基因是體外的隨機(jī)組合。但由于抗體和抗原結(jié)合的特異性常主要由VH決定，所以本發(fā)明全部特異性B細(xì)胞(Ab2β抗體產(chǎn)生細(xì)胞)，可在不改變特異性的情況下，使其每一個特異性的VH與本發(fā)明特異性B細(xì)胞不同的VL進(jìn)行組合(鏈替換)，產(chǎn)生特異性相同而親和力不同的Ab2β抗體(注：不排除某些VH與VL因空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性差和穩(wěn)定性差等原因?qū)е屡鋵κ?。因此本發(fā)明可在不改變每一個B細(xì)胞克隆特異性的情況下找到VH---VL最佳配對，反而更可能篩選到高親和力的Ab2β抗體抗體?；蛟S由于類似免疫抗體庫的原因，但本發(fā)明比免疫抗體庫更具優(yōu)越性和保障性，即全部由特異性B細(xì)胞克隆組成，如果數(shù)量足夠大而且VH---VL互補(bǔ)性強(qiáng)空間結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，這會使原始抗體輕鏈和重鏈配對極易被恢復(fù)，反而不會導(dǎo)致高親和力原始Ab2β抗體丟失。本發(fā)明通過這兩種不同方式(注：關(guān)注通用引物和簡并引物使用的方法)制備噬菌體“Ab2β抗體庫”(注：需要和具體試驗操作者協(xié)商，選擇最適合本發(fā)明的方法和技術(shù))。第二條途徑，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞(生產(chǎn)抗體為目的)，通過轉(zhuǎn)化為抗體分泌漿細(xì)胞，獲得分泌性Ab2β抗體(該途徑雖獲得的每一單個克隆抗體的數(shù)量較少，但足夠試驗所用)，制備原始特異性“Ab2β抗體庫”。

通過這兩條途徑盡可能獲得模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的全“Ab2β抗體”，并以此制備和構(gòu)建初級具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗體庫”。

(3)結(jié)合試驗和競爭抑制試驗

應(yīng)用各種常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)：(1)根據(jù)結(jié)合試驗，觀察來自第二階段不同途徑的噬菌體Ab2β抗體和分泌性Ab2β抗體與第一階段獲得的原始Ab1抗體特異性結(jié)合的效果。(2)根據(jù)競爭抑制試驗，觀察來自第二階段不同途徑的噬菌體Ab2β抗體和分泌性Ab2β抗體競爭抑制人呼吸道上皮細(xì)胞與第一階段獲得的原始Ab1抗體結(jié)合的能力，特別是能否全方位阻斷人呼吸道上皮細(xì)胞與原始Ab1抗體的結(jié)合能力(同時設(shè)置人呼吸道上皮細(xì)胞與原始Ab1抗體結(jié)合的對照組)，以此判斷本發(fā)明第二階段獲得的全方位模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的“Ab2β抗體庫”是否還存在“克隆漏洞”，本發(fā)明可通過特異性試驗彌補(bǔ)這種“克隆漏洞”，從而完善“Ab2β抗體庫”。

(4).驗證初級“Ab2β抗體庫”的功能和效果：

應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，利用引起普通感冒的各種病毒和不同流感減毒活疫苗及滅活疫苗等從初級“Ab2β抗體庫”中篩選特異性抗體，并提取和純化這種專一抗特定呼吸道病毒---靶細(xì)胞結(jié)合位點的抗體，即模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面“病毒受體”的Ab2β抗體，以此驗證初級“Ab2β抗體庫”的功能和效果。確證試驗成功的最重要標(biāo)志是：“Ab2β抗體庫”與引起普通感冒的各種病毒和不同流感特定疫苗特異性結(jié)合的范圍越廣說明成功率越高(設(shè)置巧妙的試驗對照組)，同時說明本發(fā)明“Ab2β抗體庫”構(gòu)建越完善。如果與上述病毒和疫苗特異性結(jié)合的成功率達(dá)到百分之百，則意味著本發(fā)明“Ab2β抗體庫”與未知和變異的致命性呼吸道病毒特異性結(jié)合的成功率也會極高。當(dāng)然本發(fā)明“Ab2β抗體庫”也會越來越完善。

(5).致命性呼吸道病毒中和試驗：

應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實驗技術(shù)，利用某些已知致命性呼吸道病毒或減毒活疫苗等，從初級“Ab2β抗體庫”中篩選特異性抗體，并進(jìn)行致命性病毒中和試驗(委托試驗)，確證特異性Ab2β抗體的功能和效果，制備針對某些特定致命性呼吸道病毒的特異性中和抗體，為工程抗體產(chǎn)業(yè)化和商品化產(chǎn)品-----特異性免疫球蛋白打基礎(chǔ)。

(6).制備和構(gòu)建多個具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗體庫”和“Ab2β”抗體庫”

根據(jù)人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原(如呼吸道以有包膜病毒為主，其受體表達(dá)十分豐富)的分布特點以及與Ab1抗體和Ab2β抗體相互作用的特點，通過本發(fā)明十分簡單的獨創(chuàng)性免疫試驗技術(shù)，可隨著第一階段和第二階段試驗，構(gòu)建多個具有不同功能和用途的“Ab1抗體庫”和多個相對應(yīng)的“Ab2β抗體庫”，用于篩選特異性抗病毒抗體和進(jìn)行相應(yīng)病毒中和試驗。這些抗體庫其中抗體克隆庫容量估計最大的為10⁴--10⁵。.對比一般抗體庫10⁷-10¹⁰以上庫容量，兩者在庫容總抗體數(shù)量相等情況下，本發(fā)明抗體庫每一個單克隆抗體的數(shù)量都在對方每一個單克隆抗體數(shù)量的千倍---百萬倍以上，因此本發(fā)明“Ab2β”抗體庫”與呼吸道病毒相互作用，根本就沒有淘篩失敗的可能性(注：抗體庫庫容量太大或每個特異性克隆數(shù)量太少都會影響篩選效果，因此要有度)。

另外僅從抗原的免疫原性講，動物源基因工程抗體如ScFv小分子抗體(包括雙鏈和三鏈ScFv抗體)，其免疫原性與經(jīng)過多次體細(xì)胞高頻突變和具有種間獨特型的人源抗體又有多大區(qū)別，本發(fā)明認(rèn)為兩者應(yīng)用臨床沒有多大區(qū)別。

(7)第二階段試驗需要時間12個月-18個月

(8)第二階段預(yù)期產(chǎn)品：制備和構(gòu)建多個具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗體庫”和“Ab2β”抗體庫”

(9)第二階段試驗結(jié)束后，立即向世界各大國申請發(fā)明專利，在全世界控制實驗方法和主要技術(shù)及市場……

逆向工程設(shè)計的兩種附加實驗方案

事物的兩面性理論---Ab1抗體和Ab2抗體分別屬于事物的兩個面，這一原理對本附加實驗方案啟迪：即人呼吸道上皮細(xì)胞和呼吸道病毒同樣分別屬于事物的兩個面，因此可以通過逆向工程設(shè)計兩者程序位置互換的實驗方案。

(1)把本實驗方案中的人呼吸道上皮細(xì)胞置換成特定呼吸道病毒或流感減毒活疫苗及滅活疫苗等，通過相同的本實驗方案全部試驗過程，制備抗和模擬病毒配體結(jié)合位點的Ab1抗體和Ab2β抗體，如果模擬病毒配體的Ab2β抗體能夠特異性結(jié)合人呼吸道上皮細(xì)胞，說明抗病毒配體結(jié)合位點的Ab1抗體，就是本發(fā)明所指專一阻斷特定呼吸道病毒------人呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)合部位的特異性中和抗體。

(2)把本實驗方案中的人呼吸道上皮細(xì)胞置換成特定呼吸道病毒或流感減毒活疫苗及滅活疫苗等，通過相同的本實驗方案全部試驗過程制備抗特定病毒Ab1抗體。同時制備抗人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗體。將兩種不同來源的Ab1抗體固定一方，篩選另一方(如利用所謂抗原柱純化抗體技術(shù))。其中發(fā)生特異性結(jié)合的抗體分別為模擬病毒受體的抗體和模擬病毒配體的抗體，而模擬病毒受體的抗體就是本發(fā)明所指專一阻斷特定呼吸道病毒------人呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)合部位的特異性中和抗體。

(3)該逆向工程設(shè)計的附加實驗方案，不在本次發(fā)明的試驗范圍之內(nèi)。

最后本發(fā)明目標(biāo)------.市場商品化產(chǎn)品，即走向工程抗體產(chǎn)業(yè)化道路(可根據(jù)長遠(yuǎn)和短期目標(biāo)精心制定規(guī)劃，選擇最合適工藝，)。工程抗體主要包括細(xì)胞工程抗體和基因工程抗體。細(xì)胞工程抗體，指該技術(shù)是在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，如人B細(xì)胞的EBV轉(zhuǎn)化及融合技術(shù)、雜交瘤細(xì)胞通過克隆化篩選產(chǎn)生單克隆抗體和轉(zhuǎn)基因動物作為生物反應(yīng)器通過乳汁獲得特異性抗體等各種相關(guān)技術(shù)和方法?；蚬こ炭贵w則指在基因水平上進(jìn)行操作，把特定編碼抗體分子的目的基因，轉(zhuǎn)移至大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)目的抗體等各種相關(guān)技術(shù)和方法。制備三種市場商品化產(chǎn)品----(1)抗未知和變異的呼吸道病毒人體特異性免疫球蛋白或人源化特異性免疫球蛋白。(2)抗各種已知的呼吸道病毒人體特異性免疫球蛋白或人源化特異性免疫球蛋白.。(3)僅抗1--幾個已知的特定致命性呼吸道病毒的人體特異性免疫球蛋白或人源化特異性免疫球蛋白。