[發明專利]一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應用

無效

• 申請號: 201210063966.0
• 申請日: 2012-03-12
• 公開（公告）號: CN102643861A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 周俊芳;房文紅;萬夕和
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/033;C12N15/113;C12N15/10
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬于RNAi抗病毒領域，特別涉及一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應用。

背景技術

對蝦是熱帶亞熱帶淺海最占優勢的甲殼動物，具有種類多，種群數量大，繁殖力強，生長迅速，肉味鮮美等特點。自從上世紀70年代末開始，對蝦養殖迅速發展成為一個支柱產業，不僅解決了成千上萬人的勞動就業問題，而且給財政帶來了成百上千億美金的收入和給百姓帶來了高質量的食品。但是，隨著集約化養殖技術的不斷提高和養殖面積的不斷擴大，對蝦養殖產量不斷上升，其病害問題也日益嚴重。到目前為止，已發現的養殖對蝦疾病有30多種，在過去幾年中，對蝦疾病造成的損失高達上億美元。引起對蝦疾病的病原主要有病毒、細菌、真菌和寄生蟲，其中對蝦病毒性疾病是對蝦養殖業面臨的最嚴重的問題。作為對蝦白斑癥(white?spot?disease，WSD)的病原，對蝦白斑綜合征病毒(white?spot?syndrome?virus，WSSV)以其對宿主的泛嗜性、高致病性以及高致死率而位居對蝦病毒病之首。

對蝦一般在感染WSSV48h后即可出現典型癥狀——紅體和甲殼白斑，3～10?d內死亡率可高達100％。因此，自從1993年該病首次暴發以來，幾乎每年均給我國對蝦養殖業帶來巨大經濟損失，塘口絕收現象常有發生。與其他無脊椎動物一樣，對蝦特異性免疫機制的缺乏大大增加了對其病毒防治的難度。由于疾病頻發和專用防治藥物的匱乏，導致各種消毒、防治藥物的濫用；養殖生態系統遭到持續破壞，海洋生態平衡和水產養殖業的可持續發展受到嚴重威脅。可以說，在某種程度上對蝦病害的有效控制決定了對蝦養殖業的可持續發展。到目前為止，雖然在研究人員的努力下蝦類免疫與防治已經有了相當大的進展，但仍然停留在非特異增強機體抗病能力方面，因此在遇到WSSV這樣發病迅即、病死率高的病原感染時，往往難以勝任，因而，尋求高效特異的WSSV防治方法仍然是病毒研究的重中之重。

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是在真核細胞中由雙鏈RNA(dsRNA)誘導的特異性RNA降解過程，在細胞水平和動植物體內均表現出高效特異的抗病毒能力。近幾年的相關研究證明，RNAi在水生無脊椎動物體內也能激發高效的抗病毒效應。由于WSSV基因組序列已經明確，因此，運用RNA干擾技術抗WSSV、研究抗病毒專用制劑是完全可能的。我國的水產研究專家黃倢、何建國、章曉波等團隊均實施了RNAi技術抗WSSV的研究，并取得了很好的抗病毒效果。我們也在近幾年進行了相關研究，并研究獲得自行設計的高效RNA干擾分子。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應用，該shRNA分子可顯著抑制WSSV在對蝦體內的增殖，大幅降低WSSV感染蝦的累積死亡率，有效降低WSSV對對蝦組織的損傷，抗WSSV效率高、副作用小。

本發明的一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應用，包括：

將體重7～9g、PCR檢測陰性的健康南美白對蝦在室內池塘暫養1周后，用胰島素注射器于南美白對蝦第四腹節的一側肌肉注射50μL/只shRNA分子，4h后于第四腹節的對側肌肉注射50μL/只WSSV感染液，在水溫27～28℃、每天換水1/2、24h持續充氣的條件下養殖，WSSV感染4天后檢測得南美白對蝦體內WSSV的增殖被shRNA抑制。

所述shRNA分子shWR的序列為：

5’-GGACCAACAAACCCAAGAAUUGAAGAAGUUCUUGGGUUUGUUGGUCCUU-3’。

所述shWR的制備方法包括：

(1)選取WSSV早期復制相關酶的編碼序列；

(2)利用軟件生成抗WSSV的小RNA干擾分子；

(3)按照已公布的小RNA序列設計規則，選擇一個理論上高效的小RNA分子(siRNA)；

(3)把該siRNA構建成shRNA分子，記為shWR。

所述步驟(1)中的WSSV早期復制相關酶為核糖核酸還原酶。

有益效果

本發明的shRNA分子可顯著抑制WSSV在對蝦體內的增殖，大幅降低WSSV感染蝦的累積死亡率，有效降低WSSV對對蝦組織的損傷，抗WSSV效率高、副作用??；研究結果表明，本發明的shRNA分子具有高效性和病毒特異性，可有效彌補對蝦特異免疫機制的缺陷，因此，可作為抗WSSV藥物研制的新的候選制劑。

附圖說明