[發明專利]蛋白酶抑制劑BmSPI38及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210063274.6
• 申請日: 2012-03-12
• 公開（公告）號: CN102532305A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 趙萍;李游山;夏慶友;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C12N15/15;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/57;A61P31/10;C12N15/85;A01K67/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種蛋白酶抑制劑及其制備方法和應用。

背景技術

家蠶是一種具有很高經濟價值的產絲昆蟲。然而，家蠶易受各種病原微生物和其它外界因素影響，產生疾病。昆蟲致病性真菌，如綠僵菌、球孢白僵菌、黃曲霉菌和米曲霉菌，都可引發高傳染性蠶病。一旦這些致病性真菌在桑蠶區傳播開來，將對繭絲產量和質量造成重大損失，甚至導致整個桑蠶行業的失敗。所以，采取有效措施控制家蠶真菌疾病非常重要。

超微結構和組織化學證據表明，昆蟲致病性真菌主要通過機械壓力和酶解雙重作用來穿透昆蟲體壁，進而入侵昆蟲。其中，體壁降解蛋白酶在孢子萌發時分泌于昆蟲體壁，參與宿主表皮穿透過程，是重要的毒力因子。例如，綠僵菌分泌的體壁降解蛋白酶Pr1可以激活煙草天蛾的酚氧化酶系統，增加Pr1基因拷貝數，從而顯著提高綠僵菌的毒力；球孢白僵菌分泌的體壁降解蛋白酶CDEP-1能夠加速孢子萌發和體壁穿透過程，從而顯著提高球孢白僵菌的毒力。

蛋白酶抑制劑廣泛存在于各種生物中，它們通過結合蛋白酶或介導蛋白酶受體清除信號來消除不需要的蛋白水解過程。目前，在自然界中共發現了四種蛋白酶抑制劑：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等的巰基蛋白酶抑制劑，抑制膠原酶、氨肽酶等的金屬蛋白酶抑制劑和抑制胃蛋白酶、組織蛋白酶D等的羧基蛋白酶抑制劑。其中，絲氨酸蛋白酶抑制劑的種類最多。根據序列同源性、半胱氨酸數目和分子中二硫鍵與作用位點之間的拓撲學關系，絲氨酸蛋白酶抑制劑又分為Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL（trypsin?inhibitor?like?cysteine?rich?domain）等幾個家族。目前，在家蠶的血液和絲腺等組織中發現的蛋白酶抑制劑主要以胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑為主。

蛋白酶抑制劑在許多生理過程例如消化、凝血、纖溶、補體級聯反應、酚氧化酶級聯反應、細胞遷移，激素或多肽釋放等過程中起著重要的調控作用，但其作用的具體機理目前尚不清楚。近年來研究發現，家蠶血液中的蛋白酶抑制劑在抵御微生物入侵過程中起著重要作用。例如，家蠶C124品種的真菌蛋白酶抑制劑-F（FPI-F）可以抑制白僵菌孢子的萌發和萌芽管的生長，能夠強烈抑制枯草桿菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶以及白僵菌分泌到培養基中的蛋白酶粗提物。因此，可以從家蠶蛋白酶抑制劑中尋找能夠有效對抗致病性真菌入侵的分子，以提高家蠶抗真菌能力。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于從家蠶蛋白酶抑制劑中尋找能夠對抗致病性真菌入侵的分子，闡明其對抗致病性真菌入侵的機理，并提供其制備方法以及在生物學方面的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、蛋白酶抑制劑BmSPI38，由SEQ?ID?No.2中第23位至第80位氨基酸組成。

進一步，所述蛋白酶抑制劑BmSPI38在N末端還有信號肽序列，所述信號肽序列由SEQ?ID?No.2中第1位至第22位氨基酸組成。

2、編碼蛋白酶抑制劑BmSPI38的基因。

進一步，由SEQ?ID?No.1中第137位至第313位核苷酸組成。

進一步，所述基因在5’末端還有信號肽編碼序列，由SEQ?ID?No.1中第71位至第136位核苷酸組成。

進一步，所述基因cDNA全長序列由SEQ?ID?No.1中第1位至第388位核苷酸組成。

3、含有上述基因的重組表達載體。

進一步，所述重組表達載體以p28質粒作為基礎載體，所述p28質粒由pET28a質粒刪減部分多克隆位點后獲得，刪減后的多克隆位點序列如SEQ?ID?No.10所示。

4、含有上述重組表達載體的工程菌。

進一步，所述工程菌以大腸桿菌Origami?2(DE3)菌株為宿主菌。