[發明專利]一種沙拉沙星的熒光偏振免疫分析檢測方法

無效

• 申請號: 201210063263.8
• 申請日: 2012-03-12
• 公開（公告）號: CN102621297A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 郗日沫;宋佩;尹永梅;孟萌;張太昌;田溪;薛虎寅
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: G01N33/542
• 分類號: G01N33/542;G01N33/533
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明涉及沙拉沙星的一種熒光偏振免疫分析方法，屬于熒光偏振免疫分析檢測技術領域。

技術背景

沙拉沙星(Sarafloxacin，SAR)屬于動物專用的氟喹諾酮類藥物，藥用其鹽酸鹽，具有廣譜抗菌、活性強、毒副作用小等特點，主要用于治療雞、豬的敏感細菌及支原體感染所致的疾病。據報道，鹽酸沙拉沙星的半衰期較長，在食品動物中的殘留會引起耐藥性，過量的藥物殘留也會直接危害動物及人體健康。我國規定動物性食品中獸藥沙拉沙星的最高殘留限量不超過80μg/kg。

目前，用于(氟)喹諾酮類藥物檢測的主要方法有四大類：微生物法、儀器分析法、化學發光分析法及免疫分析法。微生物法適用于檢測高濃度的藥物殘留，主要用于大量樣品的快速篩選；常用的儀器分析法有高效液相色譜法、液-質聯用分析法、高效毛細管電泳法等；此類分析法雖然具有高效、靈敏、快速準確的特點，但是使用的儀器昂貴，而且樣品前處理較繁瑣，不適合大量樣品的快速檢測；免疫分析法主要包括酶聯免疫吸附法、免疫親和柱色譜分析法、免疫傳感器分析法等。免疫分析法準確性好、靈敏度和特異性高、快速準確，可用于大量樣品的快速檢測，因此免疫分析法尤其是酶聯免疫吸附分析法(ELISA)現已廣泛應用于小分子農藥以及獸藥的快速篩選殘留檢測。但是ELISA法大多屬于非均相的免疫分析法，由于在操作過程中需要分離結合的和未結合的抗原(抗體)或酶標記物，耗時較長，所以迫切需要發展一種更加簡便快速的分析方法。

熒光偏振免疫分析法(fluorescence?polarization?immunoassay，FPIA)則具備了這一特點，是一種快速、簡便、高效、可靠的分析方法，而熒光偏振免疫分析法的關鍵是小分子熒光標記物的成功制備以及需要高特異性的抗體，當二者同時具備時，即可通過待測沙拉沙星和沙拉沙星熒光標記物同時競爭結合沙拉沙星抗體時偏振值的變化(競爭法)進行沙拉沙星的熒光偏振免疫分析，而國內尚未有關沙拉沙星熒光標記物的制備以及沙拉沙星熒光偏振免疫分析方法建立的報道。

發明內容

本發明的目的是解決傳統分析方法操作復雜費時的問題，提供一種沙拉沙星熒光標記物的制備方法以及利用熒光標記物和高特異性的抗體建立的沙拉沙星熒光偏振免疫分析方法。

本發明提供的沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，利用沙拉沙星作為半抗原偶聯FITC熒光素合成熒光標記物，并以沙拉沙星標準品，沙拉沙星多克隆抗體為抗體，建立了沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，步驟如下：

(1)沙拉沙星熒光標記物的制備：

a.稱取3～4mgSAR溶于由100μL水、500μL甲醇、50μL三乙胺組成的混合溶劑中形成A液；

b.稱取6mg異硫氰酸熒光素FITC溶于600μL甲醇中形成B液；

c.取200μLB液逐滴加入A液中，震蕩，室溫避光過夜；

d.次日，以CHCl₃∶MeOH＝2∶1(V/V)為展開劑，室溫下對c步的反應液進行薄層層析，分離純化，紫外投射儀下觀察，選擇Rf＝0.1的條帶，用120μL甲醇萃取，得到沙拉沙星熒光標記物；

(2)沙拉沙星熒光標記物工作濃度的確定：

用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸鹽緩沖液倍比稀釋得到不同濃度的沙拉沙星熒光標記物，檢測熒光偏振光強度，以5倍于空白溶液的偏振光強度所對應的濃度作為沙拉沙星熒光標記物的工作濃度；即最終選取1/12800的稀釋濃度，空白溶液選用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸鹽緩沖液；

(3)沙拉沙星多克隆抗體的工作濃度的確定：

在每個試管中依次加入500μL用2.5mmoL/L、pH＝8.0的硼酸鹽緩沖液稀釋的比例分別為1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗體(本實驗室自制)，并依次加入500μL步驟(2)確定的工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，混勻后室溫孵育5min，檢測熒光偏振光強度，以最大偏振值70％對應的抗體濃度作為抗體的最佳工作濃度，即最終選取1/1600的稀釋濃度；

(4)競爭

鹽酸沙拉沙星用雙蒸水分別稀釋成濃度為1000，100，10，2.5，1，0.25，0.1，0.01μg/mL的系列溶液并分別加入7個試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40μL/管；每管加入480μL工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480μL工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度；

(5)建立沙拉沙星的標準抑制率曲線