[發(fā)明專利]一種沙拉沙星的熒光偏振免疫分析檢測方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210063263.8 | 申請日： | 2012-03-12 |
| 公開（公告）號： | CN102621297A | 公開（公告）日： | 2012-08-01 |
| 發(fā)明（設計）人： | 郗日沫;宋佩;尹永梅;孟萌;張?zhí)?/a>;田溪;薛虎寅 | 申請（專利權(quán)）人： | 南開大學 |
| 主分類號： | G01N33/542 | 分類號： | G01N33/542;G01N33/533 |
| 代理公司： | 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002 | 代理人： | 侯力 |
| 地址： | 300071*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 沙拉 熒光 偏振 免疫 分析 檢測 方法 | ||
1.一種沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，其特征在于該方法利用沙拉沙星作為半抗原偶聯(lián)FITC熒光素合成熒光標記物，并以沙拉沙星為標準品、沙拉沙星多克隆抗體為抗體，建立了沙拉沙星的熒光偏振免疫分析方法，步驟如下：
(1)沙拉沙星熒光標記物的制備：
a.稱取3～4mgSAR溶于由100μL水、500μL甲醇、50μL三乙胺組成的混合溶劑中形成A液；
b.稱取6mg異硫氰酸熒光素(FITC)于600μL甲醇中形成B液；
c.取200μLB液逐滴加入A液中，震蕩，室溫避光過夜；
d.次日，以CHCl3∶MeOH＝2∶1(V/V)為展開劑，室溫下對c步的反應液進行薄層層析，分離純化得沙拉沙星熒光標記物；
(2)沙拉沙星熒光標記物工作濃度的確定：
用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸鹽緩沖液倍比稀釋得到不同濃度的沙拉沙星熒光標記物，檢測熒光偏振光強度，以5倍于空白溶液的偏振光強度所對應的濃度作為沙拉沙星熒光標記物的工作濃度；
(3)沙拉沙星多克隆抗體的工作濃度的確定：
在每個試管中依次加入500μL用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸鹽緩沖液稀釋的比例分別為1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗體，并依次加入500μL步驟(2)確定的工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，混勻后室溫孵育5min，檢測熒光偏振光強度，以最大偏振值70％對應的抗體濃度作為抗體的最佳工作濃度；
(4)競爭
鹽酸沙拉沙星用雙蒸水稀釋成系列溶液并分別加入試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40μL/管；每管加入480μL工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480μL工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度；
(5)建立沙拉沙星抗體的抑制率曲線
以沙拉沙星濃度為橫坐標，偏振光強度為縱坐標作圖，建立沙拉沙星抗體的抑制率曲線；
(6)交叉反應率
甲醇溶解恩諾沙星、加替沙星；pH＝5-6的稀醋酸溶解氧氟沙星；雙蒸水溶解鹽酸沙拉沙星、鹽酸環(huán)丙沙星，配制1mg/mL的標準品溶液，按照一系列濃度，用蒸餾水進行稀釋，分別加入到試管中，另設一個雙蒸水空白對照，40μL/管；每管加入480μL工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480μL工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度。
(7)實際樣品的檢測
取處理過的牛奶和豬尿40μL/管，再加入480μL工作濃度的沙拉沙星熒光標記物，最后分別加入480μL工作濃度的沙拉沙星多克隆抗體，混勻后室溫孵育5min，檢測其熒光偏振光強度。
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