[發(fā)明專利]一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210063214.4
• 申請(qǐng)日: 2012-03-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102586157A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫曉紅;蘇晨曦;盧瑛;趙勇;潘迎捷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/63
• 代理公司: 上海碩力知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31251
• 代理人: 王法男

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法。

背景技術(shù)

副溶血性弧菌是一種重要的食源性致病菌，人一旦食用被該菌污染的水產(chǎn)品，易引起腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)熱等典型胃腸道癥狀。因此，對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)是水產(chǎn)品安全檢測(cè)的重要內(nèi)容，如在進(jìn)出口水產(chǎn)品檢測(cè)的項(xiàng)目，在飲用水、食品檢測(cè)和食品中毒源、傳染病源調(diào)查等工作中，都需對(duì)該菌進(jìn)行檢測(cè)。副溶血性弧菌的傳統(tǒng)檢測(cè)需經(jīng)過(guò)增菌、選擇性培養(yǎng)、生理生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過(guò)程，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低，不利于及時(shí)診斷和流行病學(xué)溯源。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，PCR、DNA探針、ELISA等相關(guān)技術(shù)已應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測(cè)，但是食品樣品和臨床樣品中的復(fù)雜組分往往會(huì)干擾副溶血性弧菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性；且在低污染水平下，通常需要經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)以達(dá)到檢測(cè)限，因此檢測(cè)時(shí)間也大大的延長(zhǎng)。

免疫磁分離(Immonumagnetic?Separation，IMS)技術(shù)是一種對(duì)細(xì)胞和微生物進(jìn)行分離和富集捕獲的免疫學(xué)方法。它具備快速富集捕獲目的靶標(biāo)和減少其它雜質(zhì)干擾的優(yōu)勢(shì)。免疫磁珠由載體微球和免疫配基通過(guò)共價(jià)基團(tuán)偶聯(lián)而成。目標(biāo)菌體細(xì)胞表面抗原與連有磁珠的抗體結(jié)合形成菌體細(xì)胞和免疫磁珠復(fù)合物，該復(fù)合物在磁場(chǎng)作用下會(huì)發(fā)生定向移動(dòng)，聚集在磁場(chǎng)周圍，從而與其它物質(zhì)分離。IMS可以有效的分離目的細(xì)胞，并能夠有效的去除食品樣品或臨床樣品中的抑制因子，是有效的樣品前處理方法。該技術(shù)和PCR，ELISA等技術(shù)連用能夠有效的提高檢出率和靈敏度。目前，利用IMS對(duì)目的細(xì)菌的分離多采用人工操作的方法進(jìn)行，操作過(guò)程繁瑣，容易污染樣品，反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)，單個(gè)樣品的處理量有限，且不能實(shí)現(xiàn)樣品的批量處理。

系統(tǒng)是由英國(guó)Matrix公司根據(jù)免疫磁富集的原理研發(fā)設(shè)計(jì)，可進(jìn)行高通量細(xì)胞分選和免疫富集的儀器。它由兩部分構(gòu)成，一次性反應(yīng)套裝和反應(yīng)支架；反應(yīng)套裝包括反應(yīng)管和洗脫管，通過(guò)無(wú)菌管路連接，安裝在反應(yīng)支架上，在磁場(chǎng)的作用下，經(jīng)過(guò)富集和洗脫，將磁珠和菌體細(xì)胞的復(fù)合物聚集，從而完成免疫富集。該系統(tǒng)完全自動(dòng)化操作，16min內(nèi)完成IMS，單個(gè)樣品的處理量可達(dá)25-50ml，并可同時(shí)處理5個(gè)樣品，可實(shí)現(xiàn)高通量處理樣品，且較好地避免了人工操作IMS引起的資源損耗和樣品污染等問(wèn)題。目前，采用進(jìn)行免疫富集的報(bào)道僅有甲型肝炎病毒HAV(Efstathia?et?al，2008)、沙門氏菌(Warren?BR?et?al，2007)、大腸桿菌O157:H7(Willis?et?al，2011)。借助系統(tǒng)對(duì)副溶血性弧菌高通量富集捕獲的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是在于：提供一種免疫磁珠，該免疫磁珠適用于系統(tǒng)高通量富集捕獲副溶血性弧菌。

這種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，采用副溶血性弧菌的多克隆抗體，利用EDC/NHS活化法將所述副溶血性弧菌的多克隆抗體偶聯(lián)在表面包被著羧基的磁珠上，獲得制備副溶血性弧菌的免疫磁珠；重懸已偶聯(lián)多抗的免疫磁珠，將其加入到反應(yīng)管中，再加入反應(yīng)液和樣品液，在洗脫管中加入洗滌液，采用系統(tǒng)進(jìn)行免疫富集。

免疫磁珠的制備方法：

磁珠活化：用2-(N-嗎啉代)乙磺酸(pH?5)洗滌磁珠1-3次，然后加入50mg/ml的碳二亞胺溶液和50mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)20-40分鐘，得到活化的磁珠；

磁珠與多抗偶聯(lián)：將副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室溫培養(yǎng)2-4小時(shí)；加入含有1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封閉反應(yīng)20-40分鐘；加入以含0.02％(w/v)疊氮化鈉NaN3、0.1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作為保存液，配成終濃度為15mg/ml的免疫磁珠溶液。

本發(fā)明中還需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一套適用于系統(tǒng)運(yùn)行的方案，用于對(duì)副溶血性弧菌高通量富集捕獲。

解決上述技術(shù)問(wèn)題的方案為：

應(yīng)用系統(tǒng)高通量富集捕獲副溶血性弧菌的方法，其反應(yīng)步驟如下：

(1)取濃度為15mg/ml的免疫磁珠溶液不少于50μl于PBS洗滌緩沖液中反復(fù)洗滌1-3次，再加入100μl?PBS重懸免疫磁珠。

(2)安裝反應(yīng)套裝：將50ml反應(yīng)液和如步驟(1)所述100μl免疫磁珠置于樣品管，在洗脫管中加入35ml的洗脫液。