[發明專利]一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法

無效

• 申請號: 201210063214.4
• 申請日: 2012-03-12
• 公開（公告）號: CN102586157A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 孫曉紅;蘇晨曦;盧瑛;趙勇;潘迎捷
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/63
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所 31251
• 代理人: 王法男

1.一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于：采用副溶血性弧菌的多克隆抗體，利用EDC/NHS活化法將所述副溶血性弧菌的多克隆抗體偶聯在表面包被著羧基的磁珠上，獲得制備副溶血性弧菌的免疫磁珠；重懸已偶聯多抗的免疫磁珠，將其加入到反應管中，再加入反應液和樣品液，在洗脫管中加入洗滌液，采用系統進行免疫富集。

2.根據權利要求1所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于：所述免疫磁珠的制備方法為：

磁珠活化：用2-(N-嗎啉代)乙磺酸(pH?5)洗滌磁珠1-3次，然后加入50mg/ml的碳二亞胺溶液和50mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應20-40分鐘，得到活化的磁珠；

磁珠與多抗偶聯：將副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室溫培養2-4小時；加入含有1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封閉反應20-40分鐘；加入以含0.02％(w/v)疊氮化鈉NaN₃、0.1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作為保存液，配成終濃度為15mg/ml的免疫磁珠溶液。

3.根據權利要求1所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于：應用系統高通量富集捕獲副溶血性弧菌的反應過程如下：

A.取免疫磁珠溶液于PBS洗滌緩沖液中反復洗滌1-3次，再加入100μl?PBS重懸免疫磁珠；

B.安裝反應體系：將50ml反應液和如步驟A所處理后的免疫磁珠溶液置于樣品管，加入待檢測樣品拍打液，在洗脫管中加入35ml的洗脫液；

C.打開儀器，將反應套裝安裝在反應支架中，進行免疫富集。

4.根據權利要求3所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于：應用系統進行高通量富集捕獲副溶血性弧菌的反應條件為：免疫磁珠的用量為不少于0.75mg；反應液為Tris-HCl或PBS；洗脫液為PBS、PBS+0.05％Tween-20或PBS+0.1％Tween-20。

5.根據權利要求4所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于：應用系統高通量富集捕獲副溶血性弧菌的最優化反應條件，具體為：免疫磁珠的用量為1.5mg；反應液為pH?6.4的Tris-HCl；洗脫液為PBS+0.05％Tween-20。