[發(fā)明專利]一種利用復(fù)合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210062288.6
• 申請(qǐng)日: 2012-03-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103305575A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃榮醒;郁帥陸;林琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇奧普萊醫(yī)療用品有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 徐激波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料的制備領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)將膠原蛋白進(jìn)行復(fù)合酶解以制備活性膠原蛋白的方法。

背景技術(shù)

國(guó)內(nèi)目前對(duì)利用復(fù)合酶提取活性膠原蛋白的研究剛剛起步，國(guó)內(nèi)數(shù)所高校進(jìn)行了復(fù)合酶提取活性膠原蛋白的研究，在蛋白酶的選擇、酶解工藝等方面取得一定的進(jìn)展。目前采用酶解法提取活性膠原蛋白，應(yīng)用的蛋白水解酶較為單一，主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。對(duì)于大多數(shù)活性膠原蛋白的生物活性來(lái)說(shuō)，其工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的難度，主要是因?yàn)槊冈谀z原蛋白水解過(guò)程中容易變性，分離和提純難度大，檢測(cè)手段和技術(shù)不夠成熟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用復(fù)合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，該方法能夠充分的將膠原蛋白酶解，活性膠原蛋白提取率高，所制得的活性膠原蛋白的分子量分布范圍優(yōu)，該方法可以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種利用復(fù)合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟：

（1）向已經(jīng)過(guò)預(yù)處理的魚皮中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解；

（2）酶解完成后，抑制復(fù)合蛋白酶；

（3）將酶解液進(jìn)行離心，取上清液；

（4）將上清液超濾濃縮再進(jìn)行鹽析；

（5）再超濾脫鹽并濃縮，即得。

為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，步驟（1）中所述魚皮混合液濃度為2.0-8.0wt%，調(diào)節(jié)pH至2-6。

所述的復(fù)合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意兩種或兩種以上所組成。

所述的酶解按照以下條件進(jìn)行：復(fù)合蛋白酶的用量為魚皮混合液重量2.0-8.0wt%，酶解溫度是4-16℃，酶解時(shí)間6-10h，酶解反應(yīng)體系的pH值控制在5.0-9.0。

步驟（2）中所述的滅活復(fù)合蛋白酶的方法如下：向膠原蛋白酶解反應(yīng)體系中加入抑制劑。

步驟（3）中將酶解液按照以下方法離心，得到澄清透明的上清液：離心轉(zhuǎn)速為4000-5000r/min。

步驟（4）中所述的超濾濃縮按照以下條件進(jìn)行：操作壓力0.15-0.35MPa，溫度4-10℃，pH?2-6，超濾膜孔徑為10-50nm；

步驟（4）中所述的鹽析按照以下條件進(jìn)行：膠原蛋白溶液濃度為2.5-5.5%，NaCl濃度為10-30%，pH值為2-6，溫度為4-10℃。

步驟（5）中所述的超濾按照以下條件進(jìn)行：操作壓力0.5-1.0Mpa，溫度為4-10℃，pH2-6，超濾膜孔徑為100-200nm。

本發(fā)明利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶與底物的比例、底物濃度與酶水解度的關(guān)系，得到復(fù)合蛋白酶的最佳水解條件為：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例為1-3:1，復(fù)合蛋白酶的用量為魚皮混合液質(zhì)量的2.0-8.0wt%，底物濃度2.0-8.0wt%，pH5.0-9.0，在4-16℃條件下酶解6-10h，其最高膠原蛋白提取率達(dá)到91.2%。

在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明又系統(tǒng)優(yōu)化和篩選了超濾濃縮、鹽析、透析脫鹽、超濾去除小分子等工藝條件，與前面的復(fù)合蛋白酶的水解條件相配套，建立了一套完整的復(fù)合蛋白酶提取活性膠原蛋白的方法。

有益效果：本發(fā)明方法安全性高，無(wú)副作用，所制備得到的活性膠原蛋白具有提取率、純度和熱變性溫度等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1：一種利用復(fù)合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟：

（1）向已經(jīng)過(guò)預(yù)處理的魚皮中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解；所述魚皮混合液濃度為2.0wt%，調(diào)節(jié)pH至2，所述的復(fù)合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶所組成，所述的酶解按照以下條件進(jìn)行：復(fù)合蛋白酶的用量為魚皮混合液重量2.0wt%，酶解溫度是4℃，酶解時(shí)間6h，酶解反應(yīng)體系的pH值控制在5.0；

（2）酶解完成后，抑制復(fù)合蛋白酶；所述的滅活復(fù)合蛋白酶的方法如下：向膠原蛋白酶解反應(yīng)體系中加入抑制劑。

（3）將酶解液進(jìn)行離心，取上清液；將酶解液按照以下方法離心，得到澄清透明的上清液：離心轉(zhuǎn)速為4000r/min；

（4）將上清液超濾濃縮再進(jìn)行鹽析；所述的超濾濃縮按照以下條件進(jìn)行：操作壓力0.15MPa，溫度4℃，pH?2，超濾膜孔徑為10nm；所述的鹽析按照以下條件進(jìn)行：膠原蛋白溶液濃度為2.5%，NaCl濃度為10%，pH值為2，溫度為4℃；