[發明專利]新型鴨呼腸孤病毒重組σB(SigmaB)蛋白抗原、制備方法及應用

無效

• 申請號: 201210061731.8
• 申請日: 2012-03-08
• 公開（公告）號: CN102675469A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 王劭;陳少鶯;林鋒強;陳仕龍;朱小麗;程曉霞;李兆龍
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C12N15/46;C12N15/70;G01N33/569
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技術領域

本發明涉及新型鴨呼腸孤病毒重組σB蛋白抗原的制備及其在檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應用。?

技術背景

鴨出血性壞死性肝炎是由呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬新型鴨呼腸孤病毒(Novel?duck?reovirus，NDRV)引起的各種品種鴨的一種以肝臟不規則壞死和出血混雜為主要特征的疫病。不同品種鴨均易感，日齡愈小或并發感染時其發病率死亡率愈高，以5～10日齡居多，病程5～7d，發病率5％～20％、死亡率2％～15％。該痛在我國南方水禽飼養區廣泛流行，疫區有逐年擴大的趨勢，給水禽養殖業造成一定的經濟損失。?

NDRV的代表株為NP03分離株，其S3基因的序列特征在于：根據DNAStar5.0軟件包中MegAlign基因序列比較分析軟件的Clustal?W算法，所述的NDRVNP03分離株S3基因(GenBank登錄號：GQ888710)與番鴨呼腸孤病毒(Muscovy?duck?reovirus，MDRV)89330株S3基因(GenBank登錄號：AJ243881)、禽呼腸孤病毒(Avain?reovirus，ARV)176株S3基因(GenBank登錄號：AF059720)編碼區核苷酸序列及其推導的氨基酸序列分別為68.0％，66.1％；70.4％，69.3％。?

目前，除了血清中和試驗可用于檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體外，尚無其它檢測方法，雖然中和試驗是抗體檢測的經典方法，特異性好，但操作煩瑣，不適于獸醫臨床及基層應用。另外，利用NDRV全病毒作為診斷抗原時，會與抗番鴨呼腸孤病毒(Muscovy?duck?reovirus，MDRV)的血清樣品產生非特異性交叉反應。利用原核表達系統表達外源蛋白是一種簡便和高效的方法。原核表達系統生產的一些基因工程蛋白可保持必要的抗原性，能夠用于病毒感染抗體的檢測。研究表明，新型鴨呼腸孤病毒σB蛋白即屬于此類蛋白，因此應用基因工程σB蛋白作為抗原，能夠建立檢測方法用以鑒別NDRV、MDRV全病毒感染的血清抗體，這將為應用基因工程疫苗預防和控制NDRV提供重要的技術支撐。?

發明內容

本發明的目的在于提供新型鴨呼腸孤病毒重組σB蛋白抗原的制備及其在檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應用；?

本發明是通過如下技術方案來實現的：?

新型鴨呼腸孤病毒重組σB蛋白抗原，該重組原核表達抗原為His前導肽與S3基因編碼σB蛋白的融合蛋白；?

該新型鴨呼腸孤病毒σB重組蛋白抗原的制備方法是：?

a、設計擴增NDRV?NP03分離株S3基因的特異性引物：?

b、NDRV?NP03分離株培養及RNA提取：?

c、NDRV?NP03分離株S3基因的RT-PCR：?

d、原核表達載體pET-30a-C(+)-NP03-σB的構建：?

e、NDRV?σB蛋白的誘導表達?

f、重組蛋白的純化?

g、重組σB蛋白純化后的復性?

h、純化后重組σB蛋白含量的測定?

i、重組σB蛋白活性的Western-blot檢測?

將上述重組蛋白應用在間接ELISA檢測鴨血清抗NDRV抗體。?

本發明以新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)RNA為模板，通過反轉錄聚合酶鏈式反應擴增獲得NDRV?S3基因編碼區核苷酸全序列，并定向亞克隆至大腸桿菌原核表達載體pET-30a-C(+)融合表達載體，轉化入大腸桿菌BL21(DE3)宿主細胞后用IPTG誘導表達，經Ni-NTAAgarose純化，包涵體復性，獲得表達的NDRVσB重組蛋白抗原。該蛋白的表達形式是融合蛋白(His-σB)，分子量約為44kU；經免疫印跡(Western-blot)檢測表明該蛋白具有與天然蛋白相似的免疫反應活性。本發明提供一種檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體時無散毒危險、穩定性好，靈敏度高、可實現工業化生產、成本低的原核表達抗原及其制備方法。應用該表達蛋白為包被抗原的間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)可檢測鴨血清中的抗NDRV抗體。?

本發明的優點：①由于該檢測抗原是NDRV重組原核表達的σB蛋白，并非全病毒，因此應用該抗原進行檢測時絕無散毒危險。②可用于鑒別NDRV、?MDRV全病毒感染的血清抗體。③作為間接ELISA抗原檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體，其檢測敏感性高，特異性強，無交叉反應。④生產工藝先進、性能穩定、生產成本低，產品付加值高，適合工廠化生產，市場應用前景廣。?

附圖說明