[發明專利]新型鴨呼腸孤病毒重組σB(SigmaB)蛋白抗原、制備方法及應用

無效

• 申請號: 201210061731.8
• 申請日: 2012-03-08
• 公開（公告）號: CN102675469A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 王劭;陳少鶯;林鋒強;陳仕龍;朱小麗;程曉霞;李兆龍
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C12N15/46;C12N15/70;G01N33/569
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1.新型鴨呼腸孤病毒重組σB蛋白抗原，其特征是：該重組原核表達抗原為His前導肽與S3基因編碼σB蛋白的融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的新型鴨呼腸孤病毒σB重組蛋白抗原的制備方法，其特征是：

a、設計擴增NDRV?NP03分離株S3基因的特異性引物：

NDRV-NP03-S3F(上游引物)：5’-TGCAAGGATCCATGGAGGTGCGTGTGCC-3’

NDRV-NP03-S3R(下游引物)：5’-ACCCAGGTCGACTTACCACCTAC-3’

b、NDRV?NP03分離株培養及RNA提取：

取NDRV?NP03分離株種毒經尿囊腔途徑接種于12日齡非免疫番鴨胚，37℃溫箱孵育，收集48h-72h之間番鴨胚尿囊液，離心后取上清備用；NDRV?RNA提取按Trizol試劑盒說明書進行；提取的RNA用于RT-PCR；

c、NDRV?NP03分離株S3基因的RT-PCR：

(1)NDRV?NP03的反轉錄

在PCR反應管中分別加入7μL已制備的RNA，加入1μLNDRV-NP03-S3下游引物(20pmol)，70℃熱吸附10min，冰浴10min，繼續加入5×First?Standing?Buffer4μL，10mM?dNTPs?2μL，0.5μL反轉錄酶(M-MLV)5u(單位)/μL，0.25μLRNA酶抑制劑(40u)，用無RNA酶7水調至總體積20uL，瞬時離心混勻；反應程序：30℃10min，37℃60min，99℃5min；

(2)NDRV?NP03?S3基因的PCR

PCR反應體系(50μL體系)：以制備好的cDNA2μL作模版，加入相應的上、下游引物(20pmol)各1μL，2.5mM?dNTPs4μL，10×Buffer?5μL，rTaq1μL，滅菌水36μL，反應體系50μL；在PCR擴增儀內進行擴增，擴增條件為95℃5min，94℃1min，53℃1min，72℃2min，35個循環，最后72℃延伸10min結束；

d、原核表達載體pET-30a-C(+)-NP03-σB的構建：

(1)PCR產物經純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆直接連接于pMD18-T載體，連接產物轉化E.coil?JM109感受態細胞，挑取單克隆，進行PCR鑒定；

(2)以PCR鑒定正確的陽性克隆再進行PCR擴增，PCR產物用DNA純化試劑盒進行純化后，經BamH?I、Sal?I雙酶切，回收目的片段并亞克隆于表達質粒pET-30a-C(+)的BamH?I和Sal?I酶切位點之間，構建重組表達質粒pET-30a-C(+)-NP03-σB，轉化感受態宿主菌JM109，提取重組質粒進行PCR、雙酶切鑒定和序列測定。

e、NDRVσB蛋白的誘導表達

將鑒定正確的重組質粒轉化BL21(DE3)宿主菌，挑取單克隆接種于5mL(含100ug/mL卡那霉素)的LB培養基中，37℃170r/min培養過夜；取0.5mL接種于5mL?LB培養基中，37℃220r/min培養至OD₆₀₀0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度0.1mmoL/L，在37℃下培養8h，收集菌體，以6000g離心2min，去上清液，將沉淀用PBS洗滌1次，再以6000g離心2min，去上清液，1mL?PBS重懸，超聲裂解，4℃12000g離心30min，分別取一定量的上清以及用PBS重懸的沉淀，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻后，于沸水中煮沸5min，做為SDS-PAGE電泳上樣樣品；以誘導含空質粒pET-30a-C(+)的BL21(DE)3作對照；

f、重組蛋白的純化

(1)待純化樣品的制備：

按已經優化的表達條件，表達NDRV?NP03分離株重組σB蛋白菌液1000ml，收獲菌液4℃，以8000rpm/min，離心20min，菌體沉淀用TE(10mM?Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)洗滌3次，沉淀用TE溶液重懸起來；

裂解菌體獲取包涵體沉淀：對菌體進行超聲波破碎，超聲處理必須于冰浴條件下進行；超聲條件：800W，工作10S，間隔10S，重復一定次數，以4℃，10000rpm離心10min，棄上清，沉淀即為包涵體；

包涵體的裂解及可溶性蛋白的回收：獲得的不溶性包涵體用包涵體洗滌液(20mM?Tris-HCl[pH8.0]，5mM?EDTA，2M尿素)洗滌2次，將該包涵體沉淀溶解于含8M尿素Tris-HCl緩沖液，置于冰上2h，然后4℃過夜，以12000rpm，4℃離心20min，除去不溶性沉淀，取上清即為可溶性包涵體蛋白，經0.45μm孔徑小過濾器過濾，-80℃凍存備用；

(2)重組σB蛋白的親合層析純化：

①用25ml新鮮配制的預冷結合緩沖液(20mM?Tris-HCl[pH7.9]，10mM咪唑，0.5MNaCl，8M尿素)沖洗并平衡His鎳柱；

②10ml可溶性包涵體蛋白溶液(再經0.22μm過濾孔徑小過濾器過濾)重懸平衡后的His蛋白純化介質，置于50ml潔凈離心管中，室溫充分感作30min，然后重新上柱，棄掉流出液，流速為10倍柱體積/小時(柱體積，即樹脂純化柱的體積，2m1，以下均同)；

③使用15倍柱體積的結合緩沖液(含8M尿素)沖洗柱子，收集流穿峰；

④使用3倍柱體積的新鮮配制的洗脫緩沖液(20mM?Tris-HCl[pH7.9]，0.5M咪唑，0.5M?NaCl，8M尿素)洗脫，收集洗脫峰，按500μl量分裝于潔凈Eppendorf管內；

⑤純化柱的再生與保存：依次使用8倍體積的結合緩沖液和5倍柱體積的自備去離子水洗滌后，用3倍柱體積的自備20％乙醇平衡(乙醇要將介質浸沉)，4℃保存；

g、重組σB蛋白純化后的復性

將純化好的表達蛋白(含8M尿素)裝入按常規方法處理好的透析袋(截留分子量：14000Da)后，置于TGE透析液(50mmol/L?Tris-HCl，0.5mmol/LEDTA，50mmol/LNacl，10％甘油，1％甘氨酸，pH?8.0)中，4℃條件下反復透析，8小時換一次透析液，換液三次；透析后用蔗糖粉末覆蓋于透析袋表面對蛋白溶液進行濃縮，濃縮至原體積的1/4；即為純化的重組NDRVσB蛋白，-80℃凍存備用；

h、純化后重組σB蛋白含量的測定

采用紫外線吸收法定量蛋白質。將待檢樣品適當稀釋后，同時以BioPhotometer分光光度計(Eppendorf)Bradford法測定該蛋白質與考馬斯亮蘭G250結合反應后，產生的有色化合物吸收峰595nm處的OD值，同時用考馬斯亮蘭G250作為空白對照，顯示蛋白含量；NDRV-σB/His純化蛋白的質量濃度為≥1.0mg/ml；

i、重組σB蛋白活性的Western-blot檢測

將復性純化好的重組σB蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜(NC)上，用含有3％(w/v)BSA的TBS(pH＝8.0)4℃孵育過夜封閉NC膜；用TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，每次間隔10min，再加入用含有1％(w/v)BSA稀釋(1∶100)的NDRV多克隆番鴨血清，室溫搖床溫和作用90min；TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，再加入用含有1％(w/v)BSA稀釋(1∶1500)的HRP標記的兔抗鴨IgG二抗，室溫搖床溫和作用60min；TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，吸靜余液，置于DAB顯色液中顯色，結果在約44kU處觀察到了特異性的反應條帶。

3.根據權利要求2所述的新型鴨呼腸孤病毒σB重組蛋白抗原的制備方法制備的新型鴨呼腸孤病毒σB重組蛋白在間接ELISA檢測抗新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應用。