[發明專利]一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法

無效

• 申請號: 201210061407.6
• 申請日: 2012-03-10
• 公開（公告）號: CN102586156A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 朱杰;吳文坤;周呈祥
• 申請（專利權）人: 安徽聯大生物環保科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04;C12R1/07
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

?????本發明屬于生物脫氮領域，具體涉及一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法。

背景技術

?????好氧反硝化是指有氧氣的條件下發生的反硝化現象，近些年來不斷有好氧反硝化菌被分離出來（已報道的菌屬有如副球菌屬、假單孢菌屬、產堿菌屬、芽孢桿菌屬等50多個菌屬存在好氧反硝化現象），這就為生物脫氮技術提供了一個新的途徑。

好氧反硝化與傳統的反硝化相比具有如下優點：

1、在有氧條件下進行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同時在一個反應器中進行，設備與操作成本大幅下降；

2、硝化作用的產物可直接作為反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化進程加快，縮短了脫氮周期。

所以，好氧反硝化脫氮技術是當前與以后一段時間內的科學研究的熱點。

??芽孢桿菌屬的特點：

1．細菌呈直桿狀，細胞染色大多數在幼齡培養時呈G⁺，好氧或兼性厭氧，化能異氧菌，具有發酵或呼吸代謝類型；在條件不利的情況下形成芽孢，將自已保護起來，復活率高。其有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等，故以其開發產品有較高的穩定性

2．菌體生長營養要求簡單。

3．有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，對污染水體的有機物有較強的降解能力。???????

綜上所述，設計出一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，以利于快速分離、提純出高效好氧反硝化的芽孢桿菌，以期為生物脫氮作貢獻。

好氧反硝化菌的分離方法有很多，主要有：選擇性富集法；稀釋法；間歇曝氣法。

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發明內容

????本發明提供了一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，篩選出具有反硝化水體（水產養殖、與環境污染水體）中硝態氮與亞硝態氮的芽孢桿菌。

????為實現上述目的本發明采用如下技術方案：

一種簡易、快速分離篩選好氧反硝化芽孢桿菌的方法，其特征在于：選擇如土壤、池塘水樣、?泥樣或活性污泥等目標物接種于含有NO2^--N/NO3^—N的富集培養基中，進行間歇增氧富集培養；移取適量富集培養物75-80℃水浴殺除雜菌，稀釋后涂布于含NO2^--N/NO3^—N梯度平板培養；然后對培養后的平板進行噴涂NO2^--N/NO3^—N顯色液，挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落，繼續用劃線法獲得純培養物，對純培養物革蘭氏染色鏡檢，以內生芽孢桿菌的作為初篩菌株；接著利用純培養物菌體在不同NO2^--N/NO3^—N濃度的培養基中，恒溫間歇增氧培養，測定其OD600nm吸光度值，以定量的確定芽孢桿菌所適應的NO2^--N/NO3^—N濃度范圍；在確定的適中的NO2^--N/NO3^—N濃度下，用含有NO2^--N/NO3^—N的液體富集培養基，分別培養不同好氧反硝化芽孢桿菌，通過測定液體富集培養基中NO2^--N/NO3^—N含量，以求解其去除率，復篩出好氧反硝氧能力強勁的芽孢桿菌。

????所述的簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，其特征在于：所述的富集培養基：用的是LB培養基2.0-200.0?mg/lNO2^--N/NO3^—N；所述的LB培養基（g/l）:胰蛋白胨10.0，氯化鈉5.0,酵母膏10，水1000ml,PH?7.2，121℃，滅菌25-30min。

本發明的有益效果：

目前現有技術在分離反硝化細菌多用BTB培養基，利用反硝化過程中堿的特性，利用培養基中BTB（溴百里酚藍）指示劑在PH值＞7.6顯示藍色，來間接判斷有反硝化細菌的有無。其培養基組份較復雜，且營養不全面，富集培養時間長，無針對性快速分離好氧反硝化芽孢菌缺點；利用本發明的方法，具有培養基組成簡單（一般的化驗室條件均有條件），營養全面，且有促生長因子故富集培養時間短，用針對性的顯色劑噴涂，更直觀。初篩中加入水浴環節能有效提高芽孢菌的檢出率，大大降低在篩選目標菌株的工作量。應用定性與定量的方法相給合，使得工作效率更快。

總之，本發明方法具有簡易、快速、直觀、高效分離具有好氧反硝化能力芽孢桿菌的的特點，為生物脫氮技術提供了一個新的途徑。