[發明專利]煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201210061149.1
• 申請日: 2012-03-09
• 公開（公告）號: CN102586484A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 張振臣;張盼;喬奇;秦艷紅;張德勝;田雨婷;王爽;王永江
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張愛軍

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技術領域

本發明涉及生物工程技術領域中的病毒檢測方法，特別是涉及一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的半巢式RT-PCR檢測方法。?

背景技術

甘薯褪綠矮化病毒(Sweet?potato?chlorotic?stunt?virus，SPCSV)屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)成員。該病毒的基因組為雙組份單鏈正義RNA，基因組大小為17.6?kbp左右。根據血清學關系和核苷酸序列，SPCSV可劃分為東非（EA）和西非（WA）兩個株系。上世紀70年代首先在非洲發現了SPCSV，目前主要分布在非洲和南美一些國家。我國自2010年首次發現SPCSV以來，目前在全國多個甘薯種植區陸續檢測到該病毒病的存在。SPCSV是危害甘薯的主要病毒之一，特別重要的是，SPCSV可與馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的甘薯羽狀斑駁病毒協生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet?potato?virus?disease，SPVD）。SPVD是甘薯上是最嚴重的病毒病害之一，通常可使甘薯減產50%-98%，甚至絕收。?

SPCSV是SPVD的主要病原之一，主要由煙粉虱(Bemisa?babaci)以半持久方式傳播，感染SPCSV的甘薯通常會迅速形成SPVD，SPVD的流行跟煙粉虱的數量密切相關。SPCSV的長距離傳播主要通過種薯和種苗，短距離主要通過煙粉虱進行傳播。煙粉虱生存能力強、繁殖速度快。據報道，煙粉虱經過48h的飼毒就能進行有效傳染，而且煙粉虱的數量越大，病毒傳播的有效性越強。由于對SPCSV尚無特別有效的防治方法，做好煙粉虱帶毒率的檢測，加強對煙粉虱的防治，可有效減少SPCSV的蔓延擴散，減少病害引起的損失。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的檢測煙粉虱中SPCSV的方法，對于該病的預警和防治具有重要意義。?

發明內容

????本發明要解決的技術問題：提供一種簡便、快速、靈敏的半巢式?RT-PCR檢測煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的方法。?

本發明的技術方案：

一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒SPCSV的檢測方法，包括以下步驟：

（1）分別設計合成SPCSV?病毒的3條引物：

CSV70P1:?5′-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3′，

CSV70P2:?5′-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3′，

CSV70P3:?5′-TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3′，

其中K為?G?或?T，R為?A?或?G，Y為C或?T，H為A、T或C；

（2）用解剖針挑取煙粉虱，放入加有預冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進行反轉錄；

（3）以反轉錄產物作為模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2進行半巢式RT-PCR的第一輪擴增，預期擴增片段大小為431bp；利用引物CSV70P1和CSV70P3進行半巢式RT-PCR的第二輪擴增，預期擴增片段大小為170bp；

（4）用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

所述反轉錄的反應體系為10μl，包括：4?μL?RNA?模板，2μl?5×RT?buffer，0.5μL濃度為10?μmol/L的CSV70P2，1?μL濃度為10?mmol/L?的dNTPs，0.25?μL濃度為40U/μl的RNase抑制劑和0.5?μL濃度為5U/μl的AMV反轉錄酶，余量為DEPC-H₂O。反應程序為：42℃反轉錄40min，99℃?5min，5℃?5min，反應后得到反轉錄產物。?

所述半巢式RT-PCR的第一輪擴增的反應體系為25μl，包括：2.5μL10×PCR?buffer，1μL濃度為2.5mmol/L的dNTPs，濃度為10?μmol/L?的CSV70P1和CSV70P2各0.5?μL，0.2μL濃度為5U/μL的Taq酶，2.5μl反轉錄產物作模板，余量為ddH₂O；擴增的反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，完成35個循環，最后72℃延伸10min。?