[發明專利]煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201210061149.1
• 申請日: 2012-03-09
• 公開（公告）號: CN102586484A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 張振臣;張盼;喬奇;秦艷紅;張德勝;田雨婷;王爽;王永江
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張愛軍

1.一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒SPCSV的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）分別設計合成SPCSV?病毒的3條引物：

CSV70P1:?5′-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3′，

CSV70P2:?5′-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3′，

CSV70P3:?5′-TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3′，

其中K為?G?或?T，R為?A?或?G，Y為C或?T，H為A、T或C；

（2）用解剖針挑取煙粉虱，放入加有預冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進行反轉錄；

（3）以反轉錄產物作為模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2進行半巢式RT-PCR的第一輪擴增，預期擴增片段大小為431bp；利用引物CSV70P1和CSV70P3進行半巢式RT-PCR的第二輪擴增，預期擴增片段大小為170bp；

（4）用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述反轉錄的反應體系為10μl，包括：4?μL?RNA?模板，2μl?5×RT?buffer，0.5μL濃度為10?μmol/L的CSV70P2，1?μL濃度為10?mmol/L?的dNTPs，0.25?μL濃度為40U/μl的RNase抑制劑和0.5?μL濃度為5U/μl的AMV反轉錄酶，余量為DEPC-H₂O。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述反轉錄的反應程序為：42℃反轉錄40min，99℃反應5min，5℃反應5min，反應后得到反轉錄產物。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一輪擴增的反應體系為25μl，包括：2.5μL10×PCR?buffer，1μL濃度為2.5mmol/L的dNTPs，濃度為10?μmol/L?的CSV70P1和CSV70P2各0.5?μL，0.2μL濃度為5U/μL的Taq酶，2.5μl反轉錄產物作模板，余量為ddH₂O。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一輪擴增的反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，完成35個循環，最后72℃延伸10min。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二輪擴增是將第一輪RT-PCR的擴增產物稀釋20倍，取1μL稀釋產物作為第二輪PCR擴增的模板，第二輪PCR擴增反應體系為25μl，包括：2.5?μL10×PCR?buffer，1μL濃度為2.5?mmol/L的dNTPs，濃度為10?μmol/L的CSV70P1和CSV70P3各0.5?μL，0.2μL濃度為5U/μL的Taq酶，用ddH₂O補足至25?μL。

7.根據權利要求1-6任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二輪擴增的反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，完成32個循環，最后72℃延伸10min。

8.權利要求7所述的方法在檢測單頭或多頭煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的應用。