[發明專利]一種大黃魚白細胞介素－1β（IL-1β）基因克隆方法及其應用

無效

• 申請號: 201210059220.2
• 申請日: 2012-03-08
• 公開（公告）號: CN102586263A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 姚翠鸞;王志勇;黃雪娜
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/25
• 分類號: C12N15/25;C12N15/10;C07K14/545;A61K39/39
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

技術領域

本發明涉及一種大黃魚白細胞介素－1β（IL-1β）基因及其克隆方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

白細胞介素-1是1972年發現的一種細胞因子，由于其功能的多樣性，又被稱為淋巴細胞活化因子、白細胞內源性遞質、內源性熱原質等，是一種主要起免疫調節作用的激素樣肽類物質，即促炎細胞因子[1.Bazan?JF，?Timans?JC，?Kastelein?RA．?A?newly?defined?interleukin一1??Nature?1996，379?f6566)：591]。IL-1β是IL-1的主要分泌形式，與IL-1α相比，IL-1β能通過遠距分泌作用于靶細胞，在炎癥反應中的作用更為顯著[Leon?LR．?Invited?review：?cytokine?regulation?of?fever：studies?using?gene?knockout?mice．J?Appl?Physiol，2002，92(6)：2648—2655]。IL-1β?一般無前體狀態的儲存，當產生IL-1β的細胞受到刺激后，啟動IL-1β?基因轉錄，此過程通常十分短暫，而且IL-1β?的mRNA極易降解。

IL-1β?的生物學作用：細胞內產生的IL-1β?以前體形式存在，須經caspase1(又稱IL-1β轉化酶，ICE)裂解才具有生物活性并分泌至細胞外[Mariathasan?S，Newton?K，Monack?DM，et?a1．Differential?activation?of?the?inflammasome?by?caspase-1?adaptors?ASC?and?Ipaf．Nature，2004，430(6996)：213-218]。活性形式的IL-1β可引發多種生物學反應．包括激活巨噬細胞、T細胞和信號級聯反應，以及誘導環氧合酶一2(COX．2)和發熱反應[Sekiyama?A，Ueda?H，Kashiwamura?S，et?a1．A?stress-induced．?superoxide—mediated?caspase-l?activation?pathway?causes?plasma?IL-18?upregulation．?Immunity，2005，22?f6)：669—677]。大量研究發現IL-1β在多種疾病的發生、發展中起重要作用[Dinarello?CA．The?IL-1?family?and?inflammatory?diseases．Clin?Exp?Rheumatol，2002，20(5?Suppl?27)：S1-S13]，但是，目前尚無大黃魚IL-1β序列的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種大黃魚白細胞介素－1β（IL-1β）基因及其克隆方法。本發明在大黃魚疾病防治及進一步開發為醫藥產品方面具有良好應用前景，并為大黃魚分子標記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態的檢測奠定基礎。

為了達成上述目的，本發明的解決方案是：

一種大黃魚白細胞介素－1β（IL-1β）基因，具有序列表中SEQ?ID?NO.1堿基序列及SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

一種大黃魚白細胞介素－1β（IL-1β）基因的克隆方法，包括如下步驟：

(1)?從大黃魚的腎臟組織中提取總RNA；

(2)?然后進行cDNA第一鏈合成；

(3)?根據其他魚類IL-1β的保守序列設計引物進行PCR反應，得到大黃魚IL-1β基因片段，其中正向引物F1：5’?GYCAACCTCRTCATCGCC3’，反向引物R1：5’?CTGCTCARCWTCWTGYTGGAG?3’?；

(4)?又用2條基因特異性正向引物F2：5’_?GTGCTGGAGAACATAGTGGAAG?3’，F3：5’?GGGCTGAGAACCGCAAAG?3’進行大黃魚IL-1βcDNA?3’端快速擴增（3’RACE）；

(5)?然后用3條基因特異反向引物R2：5’?AGCCCAGTGTCTTGTTTG?3’和R3：5’?AAGGTTGGGTCGTTGTCC?_3’，R4：5’?GCCCTTGATACCCAGAGCC?3’對大黃魚IL-1β?cDNA?5’端進行克隆。