[發明專利]用于熒光定量檢測的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法

無效

• 申請號: 201210058754.3
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102605102A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 朱智芳;劉玉方;俞萍;李曉晨;孫克非
• 申請（專利權）人: 天根生化科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/10;C12R1/93
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 羅文群

技術領域

本發明涉及一種用于熒光定量檢測的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，屬于生物中核酸應用技術領域。

背景技術

核酸研究是現代生物學、醫學研究中的重要課題。核酸作為遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎，除了在生物體的生長發育繁殖等生命活動中有十分重要的作用外，它與生命的異常情況，如腫瘤發生、放射損傷、遺傳疾病等也有密切關系。在醫學上對于臨床診斷和治療監測越來越重視，同時相應的對病毒核酸的提取及定量檢測的方法也越來越受關注。目前用于病毒核酸定量檢測的方法基本上是利用熒光定量檢測技術來測定，這種實時定量檢測方法不但方便簡單且不易引起污染，所以應用越來越廣泛。而對于病毒核酸的提取方法主要有以下幾種：一步法、煮沸法、過柱法和磁珠法。據調查研究表明：磁珠法自動化程度高，提取速度快，提取效率高，可重復性好，抗干擾能力及對擴增試劑的兼容能力強。因而磁珠法被廣泛應用于常規科研、基因組學、疾控系統、食品安全、法醫等領域。

目前病毒核酸的磁珠法提取及檢測流程為：樣品裂解—磁珠與待分離病毒核酸(以下簡稱DNA)特異性結合—磁珠-DNA混合物的洗滌—磁珠與待分離DNA的洗脫分離—取洗脫液進行定量檢測(即裂解-結合-洗滌-洗脫-檢測五步)。該方法整個過程分為五步，其中第四步需要孵育洗脫分離，對于想快速提取并檢測的使用者較為繁瑣。

發明內容

本發明的目的是提出一種用于熒光定量檢測的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，采用特殊的病毒裂解液提取病毒核酸，以使提取工藝簡單、高效、快速，方便地進行病毒核酸的提取和檢測。

本發明提出的用于熒光定量檢測的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，包括以下步驟：

(1)將10～50微升待測樣本加入到聯排管中，聯排管中含有：體積為待測樣本體積3倍的病毒裂解液以及10微升磁珠，混勻，使核酸釋放，磁珠與核酸結合，得到核酸和磁珠的混合物，其中所述的病毒裂解液的成分為：摩爾濃度為5～6摩爾/升的異硫氰酸胍、摩爾濃度為50～100毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、摩爾濃度為1～10毫摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉、摩爾濃度為50～65毫摩爾/升的二硫蘇糖醇、25～30微克/毫升的糖原、體積比為1％的聚乙二醇辛基苯基醚、體積比為2％的非離子表明活性劑-NP40、體積比為0.5％的吐溫80；

(2)將上述含有核酸和磁珠的混合物的聯排管置于磁力架上，通過磁力作用將吸附有核酸的磁性顆粒與溶液分開，棄掉溶液，取下聯排管；

(3)向上述步驟(2)的聯排管中加入100微升去蛋白緩沖液，充分混勻，在磁場作用下使磁性顆粒與液體分開，棄掉溶液，取下聯排管；

(4)向上述步驟(3)的聯排管中加入100微升去鹽漂洗液，充分混勻，在磁場作用下使磁性顆粒與液體分開，棄掉溶液，取下聯排管；

(5)將上述步驟(4)的聯排管置于室溫，晾干2分鐘，充分揮發管中殘余液體。

本發明提出的用于熒光定量檢測的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，其優點是：

1、本發明提出的病毒核酸的提取方法中，在裂解時使用了特殊的病毒裂解液，這種裂解液不僅增加了細胞裂解效果，裂解徹底而且快速，更重要的是它能夠屏蔽磁珠對熒光定量檢測的抑制作用，從而可以直接進行檢測。

2、本發明提出的病毒核酸的提取方法中，省去了磁珠與待分離DNA的洗脫分離，操作更為方便快捷，省去了長時間孵育的過程。

3、使用本發明的病毒核酸的提取方法，提取得到磁珠核酸混合物用于熒光定量檢測，可以極大的提高熒光檢測靈敏度，即使微量的核酸病毒樣本也可以進行檢測，節省了檢測成本，提高了檢測效率。

4、本發明提出的病毒核酸的提取方法中，每個樣品的提取和檢測過程在一管中完成，不僅不易引起污染，而且簡化了操作步驟，這不但節約了生產成本而且還提高了操作的準確性。

5、使用本發明的病毒核酸提取方法，提取核酸的效率高，得到的核酸純度高，檢測重復性好，對熒光檢測中的擴增試劑的兼容性好，極大的方便了臨床診斷以及法醫鑒定等方面的工作。

附圖說明

圖1是利用本發明方法提取的病毒核酸與已有的洗脫法(DP327)提取的病毒核酸進行熒光定量檢測的擴增曲線比較圖。

圖2是本發明方法的實施例中樣本濃度梯度稀釋后提取并熒光定量檢測的擴增曲線圖。

具體實施方式

本發明提出的用于熒光定量檢測的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，包括以下步驟：