[發明專利]應用生物反應器灌流培養制備狂犬疫苗的方法

無效

• 申請號: 201210058473.8
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102552899A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 陶雷;朱昌林
• 申請（專利權）人: 長春百克生物科技股份公司
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;C12N7/00;C12N7/02;A61P31/14
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 寧濤;張廣育

技術領域

本發明涉及制備狂犬疫苗的方法，具體涉及應用生物反應器灌流培養制備狂犬疫苗的方法。

背景技術

狂犬病疫苗是預防狂犬病的唯一有效手段。采用Vero細胞做為生產基質制備狂犬疫苗是國內外目前主要采用的工藝，Vero細胞是WHO推薦使用的人用疫苗生產基質。早期Vero細胞制備狂犬病疫苗大多數采用轉瓶生產工藝，由于受到轉瓶表面積和培養條件的限制，細胞密度低，勞動強度大，操作過程易污染，疫苗質量難以得到保證。自從60年代微載體生物反應器培養技術建立以來，生物反應器便以其高密度、大規模、低成本的優勢引起廣泛關注。生物反應器培養工藝，具有綜合成本低、批量大、批間差小、所獲得病毒抗原含量高等優點。國內外許多企業對其在疫苗生產中的應用進行了廣泛研究，有多家研究機構對貼壁依賴性細胞用生物反應器流加式培養(Fed-batch?culture)方法進行了研究，但尚未將灌流式培養(Perfusion?culture)方法用于Vero細胞狂犬疫苗生產。灌流式培養是一方面新鮮培養基不斷加入反應器，另一方面又將反應器液體不斷取出，使培養環境相對穩定。我們將生物反應器技術和灌流式培養技術結合起來，以微載體為載體，VERO細胞做為生產基質針對狂犬病疫苗大規模工業化生產進行了研究，取得了很好的效果。

生物反應器灌流式培養與流加式培養方式的原理與比較：生物反應器流加式培養的原理：通過流加高濃度葡萄糖和谷氨酰胺，使培養液中的葡萄糖和谷氨酰胺的濃度控制在設定范圍內。生物反應器灌流式培養的原理：通過調節灌流速率，將反映細胞代謝活性的某一環境變量控制在設定點。使用流加式培養方式，使得細胞密度和目標產物濃度有所提高，但有時往往提高的不多。因為有三十多種甚至更多的營養物質的濃度需要控制，僅控制葡萄糖和谷氨酰胺的濃度是不高的。采用灌流式培養，可以更精確地控制培養液中的各種營養物質的濃度，使得細胞密度和目標產物濃度大幅提高，彌補了流加式培養方式的不足。

使用生物反應器灌流式培養不僅大大提高了細胞生長密度和病毒液的滴度，而且有助于產物的純化，較其他方式的生物反應器方法進一步提高了產物的效力和產量。

發明內容

本發明將生物反應器技術和灌流式培養技術結合起來，原理是細胞生長在反應器中懸浮的微載體上，并且通過灌流式系統不斷地更新培養液和提供細胞生長和病毒表達所需要的氣體環境，以使細胞的生長和病毒的表達達到最佳狀態。本發明還通過大量實驗找出了適于該方法的涉及接種量、培養液組成、反應器參數等的各項最佳條件，采用這些條件下的生物反應器灌流培養使單位時間內病毒產量得到了很大的提高。

本發明提供一種應用生物反應器灌流培養狂犬病毒的方法，其包括以下步驟：

a)用添加有8-10％小牛血清和1-2％谷氨酰胺、PH值被調節為7.4-7.8的MEM培養基復蘇VERO細胞；

b)在生物反應器中用含8-10％小牛血清的MEM溶液作為預孵液將微載體孵育20-24小時；

c)將步驟a)中的復蘇VERO細胞接種至步驟b)中的包含微載體的生物反應器中進行培養，接種量為1.8×10⁹-2.2×10⁹個細胞，所述反應器連接有灌流系統，所述灌流系統主要由與液位電極偶聯的具有補液和排液功能的蠕動泵組成；

d)反應器內細胞長滿單層后，按0.1-0.001MOI加入aG加入狂犬病毒株，吸附4-5小時后開啟灌流系統，補加添加有0.5-1％人血白蛋白和1-2％谷氨酰胺，PH值被調節為7.4-7.8的MEM培養基作為細胞維持液，進液量和出液量相同，反應器內培養體積恒定；

e)病毒接種48-72小時后進行病毒液收獲，連續收獲14-20天；

f)濃縮、滅活、純化和稀釋后，制成疫苗。

在一個優選實施方案中，步驟c)中加入的VERO細胞為由130代VERO細胞復蘇至135代的細胞。

在一個更優選的實施方案中，步驟c)中加入的VERO細胞在加入反應器之前用胰蛋白酶消化。

在一個更優選的實施方案中，步驟c)中培養的反應器參數設置為溫度34-37℃、轉速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧20-30％。

在一個更優選的實施方案中，步驟d)中開啟灌流系統后的反應器參數設置為溫度34-38℃、轉速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧15-25％，出液泵速25％，進液泵速100％，進液量和出液量為每24小時一個罐體積。