[發明專利]應用生物反應器灌流培養制備狂犬疫苗的方法

無效

• 申請號: 201210058473.8
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102552899A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 陶雷;朱昌林
• 申請（專利權）人: 長春百克生物科技股份公司
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;C12N7/00;C12N7/02;A61P31/14
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 寧濤;張廣育

1.一種應用生物反應器灌流培養狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)用添加有8-10％小牛血清和1-2％谷氨酰胺、PH值被調節為7.4-7.8的MEM培養基復蘇VERO細胞；

b)在生物反應器中將微載體用含8-10％小牛血清的MEM溶液作為預孵液孵育20-24小時；

c)將步驟a)中的復蘇VERO細胞接種至步驟b)中的包含微載體的生物反應器中進行培養，接種量為1.8×10⁹-2.2×10⁹個細胞，所述反應器連接有灌流系統，所述灌流系統主要由與液位電極偶聯的具有補液和排液功能的蠕動泵組成；

d)反應器內細胞長滿單層后，按0.1-0.001MOI加入aG加入狂犬病毒株，吸附4-5小時后開啟灌流系統，補加添加有0.5-1％人血白蛋白和1-2％谷氨酰胺，PH值被調節為7.4-7.8的MEM培養基作為細胞維持液，進液量和出液量相同，反應器內培養體積恒定；

e)病毒接種48-72小時后進行病毒液收獲，連續收獲14-20天；

f)濃縮、滅活、純化和稀釋后，制成疫苗。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c)中加入的VERO細胞為由130代VERO細胞復蘇至135代的細胞。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟c)中使用的VERO細胞在加入反應器之前用胰蛋白酶消化。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟c)中培養的反應器參數設置為溫度34-37℃、轉速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧20-30％。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，步驟d)中開啟灌流系統后的反應器參數設置為溫度34-38℃、轉速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧15-25％，出液泵速25％，進液泵速100％，進液量和出液量為每24小時一個罐體積。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用PALL超濾器和截留分子量為30W的密理博膜包按20-30倍比例進行濃縮，并且超濾器的系統參數設定為溫度4-8℃、泵速50-60rpm、壓力差0.1-0.3pa。

7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用β-丙內酯作為滅活劑進行滅活，按1/3000-1/6000濃度加入，在2-8℃下滅活20-24小時，然后在37℃下水解24小時。

8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用阿瑪西亞層析系統和瓊脂糖凝膠Sepharose?4FF進行純化，系統參數設定為波長280、溫度4-8℃、泵速50-80rpm、壓力0.1-0.4pa.

9.根據權利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用的稀釋液為含3％人血白蛋白溶液的PBS。

10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所用微載體為GE公司的Cytodex1微載體，所用反應器為NBS公司的4500或310型反應器。