[發(fā)明專利]東亞鉗蝎蝎毒中的GPCR活性多肽及其提取分離和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210058463.4
• 申請(qǐng)日: 2012-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN103304630A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁鑫淼;許俊彥;張巖;張秀莉;王志偉;奧利維爾·奇韋利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06;C07K1/20;C07K1/16;C07K1/14;A61K38/08;A61P25/04
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從東亞鉗蝎蝎毒中分離得到的新的活性多肽及其分離純化方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蝎子屬節(jié)肢動(dòng)物門，蛛形綱，蝎目，鉗蝎科。蝎子的藥用始載于《開寶本草》，《本草綱目，為中醫(yī)珍貴藥材，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙，攻毒散結(jié)，通絡(luò)止痛的功效，可用于小兒驚風(fēng)，抽搐痙攣，中風(fēng)口歪，半身不遂，破傷風(fēng)，風(fēng)濕頑痹，偏正頭痛，瘡瘍，瘰疬等疾病的治療。

我國(guó)境內(nèi)的主要的蝎種是東亞鉗蝎，分布于長(zhǎng)江以北至遼寧鐵嶺等地區(qū)。對(duì)東亞鉗蝎蝎毒的研究表明，該毒液中含多種蝎毒素，包括昆蟲類神經(jīng)毒素，甲殼類神經(jīng)毒素，哺乳動(dòng)物神經(jīng)毒素，抗癲癇活性的多肽，鎮(zhèn)痛活性多肽等，能特異性作用于各種離子通道。因此，東亞鉗蝎蝎毒中的這些大量的活性多肽，是新藥發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要來源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種從東亞鉗蝎蝎毒中分離得到的活性多肽及其分離方法，以及該活性多肽具有μ-，δ-和κ-阿片受體活性。

本發(fā)明所提供的活性多肽序列是利用質(zhì)譜方法測(cè)得其氨基酸序列的，序列為Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide，該多肽的C-端被酰胺化，分子量870.3088Da，命名為BmK-YA。以及在其基礎(chǔ)上氨基酸改造的活性多肽Phe⁴-BmK-YA，序列為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。這兩個(gè)多肽都為一級(jí)線性結(jié)構(gòu)多肽。

本發(fā)明所提供的活性多肽BmK-YA的分離方法為：

a.將凍干的東亞鉗蝎蝎毒用5％乙腈(含0.1％TFA)溶解，然后上樣至C18固相萃取柱進(jìn)行固相萃取，收集洗脫液并且凍干。

b.將上述凍干樣品溶解于5％乙腈(含0.1％TFA)，并用反相色譜C18(XTerra?MS?C18，長(zhǎng)100mm，直徑19mm，Waters公司產(chǎn)品)進(jìn)行第一維粗分離，收集活性組分并凍干(參考圖1)。

c.將凍干的活性組分樣品溶解于50％乙腈，用親水作用色譜柱ClickMaltose(長(zhǎng)150mm，直徑4.6mm.，大連思譜精工有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行分離得到活性多肽(參考圖2)。

本發(fā)明所提供的多肽BmK-YA和Phe⁴-BmK-YA，在表達(dá)了阿片受體的穩(wěn)定細(xì)胞株上進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)具有阿片受體活性：BmK-YA對(duì)δ-阿片受體的活性為2.6μM，μ-阿片受體的活性為17μM，κ-阿片受體的活性為30μM.Phe⁴-BmK-YA對(duì)δ-阿片受體的活性為157nM，μ-阿片受體的活性為57nM，κ-阿片受體的活性為77nM.

附圖說明

圖1為第一維反相色譜分離的色譜圖：帶*號(hào)的峰為活性組分。

圖2為第二維親水色譜分離的色譜圖：箭頭標(biāo)出的為活性多肽BmK-YA的色譜峰。

圖3為活性多肽的二級(jí)MSMS譜圖及氨基酸序列分析圖。

圖4為合成的BmK-YA對(duì)HEK293T內(nèi)Ca²⁺濃度的劑量效應(yīng)曲線。

圖5為合成的Phe⁴-BmK-YA對(duì)HEK293T內(nèi)Ca²⁺濃度的劑量效應(yīng)曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明從東亞鉗蝎蝎毒中分離的新結(jié)構(gòu)多肽，并對(duì)其G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)活性進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用RPLC-HILIC二維液相色譜聯(lián)用方法從該毒素中純化分離出一個(gè)由8個(gè)氨基酸組成的多肽BmK-YA，質(zhì)譜法測(cè)得該肽的序列為Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide，分子量為870.3088Da，并用鈣離子測(cè)定法測(cè)定了該多肽的GPCR活性。根據(jù)其序列組成，對(duì)此活性多肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，合成了另一活性多肽Phe⁴-BmK-YA，序列為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。本發(fā)明中的BmK-YA和Phe⁴-BmK-YA均具有μ-，δ-和κ-阿片受體活性，具有作為鎮(zhèn)痛藥的前景。

1.東亞鉗蝎蝎毒活性多肽BmK-YA的純化分離