[發明專利]Bt殺蟲蛋白Cry1Ac-a的表達體系

有效

• 申請號: 201210057572.4
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102586286A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 宋志平;覃曉萍;肖滿秋;馮延葉;楊忠
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/325;C12R1/19
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于分子生物學和生物技術領域，具體涉及一種人工合成的Bt殺蟲蛋白Cry1Ac-a的表達體系，包括人工合成的Bt殺蟲蛋白的基因，含有這種基因的表達載體和該基因表達的產物。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thur?ingiens?,?Bt）殺蟲晶體蛋白對農業上許多重要害蟲都具有高特異的殺蟲活性，但是對人、脊椎動物、植物都完全無害，在自然界中可以被完全降解，因此被廣泛用于蟲害防治。轉Bt?作物的應用為害蟲防治開辟了新途徑，降低了化學殺蟲劑的使用量。隨著水稻轉基因技術研發和轉基因品種培育的開展，我國目前培育出了多個轉Bt基因的水稻品種，這些品種在通過生物安全評價后將被環境釋放而推廣應用，以滿足不斷增長的糧食需求。

轉Bt作物新品種在被大量應用于農業生產前，必須對其進行生物安全性評價，以確保轉基因品種的使用安全和環境安全。轉基因生物安全評價主要是對轉入的異源蛋白釋放后產生的影響進行評估，因此進行轉基因生物安全評價就必須獲得大量與轉基因作物表達一致的蛋白。

Cry1Ac蛋白是Bt殺蟲晶體蛋白中的一種，對鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲具有特異性的高毒殺能力，是目前轉基因水稻中普遍使用的的一種殺蟲晶體蛋白。轉入水稻的Cry1Ac蛋白通常經過修飾激活。蛋白質的生物活性表現出與其氨基酸序列的高度相關性，氨基酸序列決定蛋白質的高級結構，而高級結構是蛋白質生物活性的基礎，氨基酸序列的微小差別可能導致生物活性的完全不同，因此，轉Bt基因品種中的Cry1Ac蛋白與其在蘇云金芽孢桿菌中原始的大小、結構和活性均有差別。

本發明之前，Cry1Ac蛋白的獲得一直依賴于進口。進口的高純Cry1Ac蛋白價格十分昂貴，而且也與轉入水稻中的編碼基因產生的殺蟲蛋白有差異。而利用蘇云金芽孢桿菌提取得到的蛋白與轉入水稻的Cry1Ac蛋白存在結構上的差異，并且作為原毒素，不能在宿主體外表現出生物活性。使用酶切激活后又引入雜蛋白，因此不能夠直接利用其進行科學的評價實驗。由于雜蛋白的存在需要再次進行分離提純才能保證蛋白純度，操作繁瑣復雜。除此之外，Bt毒蛋白占植物總可溶性蛋白中的比例很小，從轉基因植物體中直接分離難度較大，很難從轉基因作物中直接獲得足夠的該殺蟲蛋白。普通的蛋白質原核表達體系由于存在密碼子偏好性的問題，也難以得到Cry1Ac蛋白的高效表達。

本發明對Cry1Ac編碼框和編碼序列進行了改造和優化，使之能夠在大腸桿菌中穩定表達得到Cry1Ac-a，Cry1Ac-a與轉入水稻中的編碼序列表達的殺蟲蛋白在氨基酸序列和結構上保持一致。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人工合成的Bt殺蟲蛋白Cry1Ac-a的表達體系，包括人工合成的Bt殺蟲蛋白的基因，含有這種基因的表達載體和該基因表達的產物，以克服上述技術缺陷，使得該蛋白在大腸桿菌中高表達，高效、低成本獲得Cry1Ac-a蛋白。

本發明提供的人工合成的Bt殺蟲蛋白的基因，是對Cry1Ac編碼框和編碼序列進行了改造和優化而獲得，即對Cry1Ac蛋白編碼框優化后再進行大腸桿菌密碼子偏好優化，并在5’端和3’端分別引入與表達載體一致的NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點，氨基酸序列末端加入終止密碼子TAA而獲得。該基因序列見序列表SEQ?ID?No.1，記為Cry1Ac-a。編碼表達的?的Cry1Ac-a蛋白氨基酸序列與轉入水稻的殺蟲蛋白氨基酸序列一致，具有殺蟲活性,氨基酸序列見序列表SEQ?ID?No.2。改造后的Cry1Ac-a蛋白由615個氨基酸組成，分子量為68.7KD，等電點為5.42。

本發明提供的上述基因的表達載體，是將化學合成的上述基因Cry1Ac-a?的DNA片段通過NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接到同樣酶切pET43.1a載體上(?pET43.1a質粒載體可由市售，本實驗室保藏)而獲得，記為pET43.1a-Bt。

同本發明還提供利用上述含該基因表達載體生產的重組Cry1Ac-a殺蟲蛋白。其方法是將獲得的重組載體轉入表達宿主BL21菌株中，得到表達菌，記為BL21(pET43.1a-Bt），發酵重組表達菌株，加入IPTG誘導高效表達，即獲得有活性的Cry1Ac-a殺蟲蛋白。

綜上，Cry1Ac-a蛋白的表達方法，其步驟可歸納如下：