[發明專利]一種從蠟樣芽孢桿菌高密度發酵液中提取蛋白質的方法

有效

• 申請號: 201210056365.7
• 申請日: 2012-03-06
• 公開（公告）號: CN102703550A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 胡永紅;楊文革;王瑞榮;唐容容
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/30;C07K1/14;C12R1/085
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

1.一種從蠟樣芽孢桿菌高密度發酵液中提取蛋白質的方法，其具體步驟如下：

1）、高密度發酵培養：將蠟樣芽孢桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養基后培養，選取一個單菌落，挑取菌體，接入裝有種子培養液培養基的錐形瓶中，錐形瓶裝液量為錐形瓶體積的17～23%，置于搖床中培養16～20h得種子液；再移取發酵培養基體積分數比為3～9%的種子液培養基接入發酵罐中發酵培養，其中發酵罐裝液量為發酵罐體積的30～50%，控制溫度、通氣量、攪拌速率和pH，培養36～48h得發酵液；其中蠟狀芽孢桿菌，菌種的拉丁學名是Bacillus?cereus，參據的微生物：NJYH?63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC?No.4348；

2）、冷凍離心：將步驟1）中的發酵液裝入離心管中，置于4～8℃冷凍離心機中離心得到液相和沉淀，沉淀滅菌后丟棄；

3）、硫酸銨分級沉淀：首先，將步驟2）中的液相置于攪拌儀上，在5～28℃溫度下加入固體硫酸銨，使硫酸銨飽和度達到相應溫度下的20～30%，充分攪拌60～120min后，離心收集第一級沉淀物和第一級上清液；將此離心獲得的第一級上清液轉入另一個容器中，以硫酸銨飽和度15～25%為梯度，繼續加入固體硫酸銨充分攪拌，即離心收集到含蛋白組分的第二、三級沉淀物；

4）、透析：分別將上述含蛋白組分的第二、三級沉淀物的離心管固定好，分別將沉淀物重懸于含15～25%體積分數Tris堿的蒸餾水中，使懸液中沉淀物的濃度達到5～10mg/mL；將懸液移至透析袋中，排出空氣，透析袋中懸液的裝液量為透析袋體積的40～50%，將透析袋兩頭扎死，在4～8℃溫度條件下，用蒸餾水透析4～8h，期間換液1～3次，再轉至緩沖液中；相同溫度條件下繼續透析24～36h；將透析好的蛋白質冷凍干燥后保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征是：步驟1）種子液培養基的組分：蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉膏3.0～8.0g/L，NaCl?3.0～8.0g/L，葡萄糖5.0～20.0g/L，控制pH7.0～7.5。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征是：步驟1）發酵培養基的組分：蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉膏3.0～8.0g/L，NaCl?3.0～8.0g/L，葡萄糖5.0～20.0g/L，KH₂PO₄?1～5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.1～1.5g/L，MnCl₂·4H₂O?0.001～0.005g/L。

4.根據權利要求1所述的方法，步驟1）發酵培養過程中溫度控制在30～37℃，?通入無菌空氣，通氣量為7～15L/（L·min），攪拌速率300～450rpm，pH控制在7.0～7.5。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟4）緩沖液的成分：8～10mmol/L?Tris-HCl、0.1～0.25mol/L?NaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征是：步驟2）中冷凍離心時間為5～10min，冷凍離心的轉速控在：7000～10000rmp。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征是：步驟3）離心過程中控制轉速為10000～12000rmp、離心時間為15～20min。?