[發(fā)明專利]一種從蠟樣芽孢桿菌高密度發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210056365.7
• 申請日: 2012-03-06
• 公開（公告）號: CN102703550A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 胡永紅;楊文革;王瑞榮;唐容容
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/30;C07K1/14;C12R1/085
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)的提取方法，具體涉及一種高活力蠟樣芽孢桿菌Bacillus?cereus?CGMCC?No.4348高密度發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法。?

背景技術(shù)

蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)是一種桿狀需氧的革蘭氏陽性細菌，主要分布于空氣、塵埃、土壤、水及植物中，能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生芽孢。與營養(yǎng)體細胞相比，芽孢對熱的抗性高105倍或更多，對紫外線和離子輻射的抗性高100多倍，對抗菌素及其他化學藥品的抗性也高，能夠抵御各種不良環(huán)境。眾多研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌是土壤中優(yōu)勢菌，對植物根際有促生、防病等功效。大多數(shù)菌種與動植物關(guān)系密切并形成良好的共生體系，能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，作為生物防治中研究和應用比較廣泛的一株拮抗細菌，蠟樣芽孢桿菌及其產(chǎn)生的代謝物正越來越受到人們的重視。蠟樣芽孢桿菌不但其本身可以被制成微生物菌劑和微生物肥料，其產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)也是種類豐富，其中包括細菌素、多肽抗生素、酶類、殺蟲外毒素、激素、溶血素等。?

代謝產(chǎn)物的合成是靠菌來完成的。菌量越多，自然產(chǎn)量也越大，條件是菌的生產(chǎn)力能保持在最佳狀態(tài)和具備適當?shù)纳a(chǎn)條件。細胞高密度培養(yǎng)一般是指微生物沉沒培養(yǎng)時其細胞密度達到100g/L-200g/L的水平。最早應用于生產(chǎn)單細胞蛋白、乙醇。細胞高密度培養(yǎng)曾成功地應用于各種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，這也是它為什么一直受到重視的原因。菌體發(fā)酵液中含有多種成分復雜、未知的蛋白質(zhì)，而且多數(shù)微生物能夠產(chǎn)生至少兩種以上的抗菌物質(zhì)。在這樣一種混合體系中，抑菌物質(zhì)的分離純化程度要根據(jù)研究工作的類型而定。常規(guī)的蛋白質(zhì)分離提取技術(shù)對于抗菌蛋白的提取是可行的，然而作為性質(zhì)特異的物質(zhì)如環(huán)肽，脂肽等，結(jié)構(gòu)性質(zhì)方面差異很大，分子量通常比較小，某些常規(guī)的蛋白層析、電泳技術(shù)并不適合或需要進一步改進，因此給抗菌蛋白的分離純化工作帶來了難度。?

本發(fā)明中為了便于沉淀后較好地分離出蛋白質(zhì)，選擇了硫酸銨鹽析法，與陶黎明等人用有機溶劑沉淀分離提取蛋白質(zhì)相比較，有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)需要在低溫條件下進行，而該提取法只需在常溫下進行，便于操作。針對當前蠟樣芽孢桿菌制劑普遍存在產(chǎn)品有效期不長、貨架期短的問題，從蠟樣芽孢桿菌Bacillus??cereus?CGMCC4348發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)，獲得生產(chǎn)所需要的活性物質(zhì)，為新型微生態(tài)制劑的生產(chǎn)提供模板。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，而提供了一種工藝簡單、提取率高，且提高了不同分子量蛋白質(zhì)的得率的一種從蠟樣芽孢桿菌高密度發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法。?

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種從蠟樣芽孢桿菌高密度發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法，其具體步驟如下：?

1）、高密度發(fā)酵培養(yǎng)：將蠟樣芽孢桿菌（其分類命名為蠟狀芽孢桿菌，菌種的拉丁學名是Bacillus?cereus，參據(jù)的微生物：NJYH?63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC?No.4348。）菌株接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng)，選取一個單菌落，挑取菌體，接入裝有種子培養(yǎng)液培養(yǎng)基的錐形瓶中，錐形瓶裝液量為錐形瓶體積的17～23%，置于搖床中培養(yǎng)16～20h得種子液；再移取發(fā)酵培養(yǎng)基體積分數(shù)比為3～9%的種子液培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的30～50%，控制溫度、通氣量、攪拌速率和pH，培養(yǎng)36～48h得發(fā)酵液；?

2)、冷凍離心：將步驟1)中的發(fā)酵液裝入離心管中，置于4～8℃冷凍離心機中離心得到液相和沉淀，沉淀滅菌后丟棄；?

3)、硫酸銨分級沉淀：首先，將步驟2)中的液相置于攪拌儀上，在5～28℃溫度下加入固體硫酸銨，使硫酸銨飽和度達到相應溫度下的20～30％，充分攪拌60～120min后，離心收集第一級沉淀物和第一級上清液；將此離心獲得的第一級上清液轉(zhuǎn)入另一個容器中，以硫酸銨飽和度15～25％為梯度，繼續(xù)加入固體硫酸銨充分攪拌，即離心收集到含蛋白組分的第二、三級沉淀物；?

4)、透析：分別將上述含蛋白組分的第二、三級沉淀物的離心管固定好，分別將沉淀物重懸于含15～25％體積分數(shù)Tris堿的蒸餾水中，使懸液中沉淀物的濃度達到5～10mg/mL；將懸液移至透析袋中，排出空氣，透析袋中懸液的裝液量為透析袋體積的40～50％，將透析袋兩頭扎死，在4～8℃溫度條件下，用蒸餾水透析4～8h，期間換液1～3次，再轉(zhuǎn)至緩沖液中；相同溫度條件下(4～8℃)繼續(xù)透析24～36h；將透析好的蛋白質(zhì)冷凍干燥后保存。?