[發(fā)明專利]口蹄疫病毒VP1基因重組小反芻獸疫病毒活載體疫苗構(gòu)建及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210056072.9
• 申請日: 2012-03-06
• 公開（公告）號: CN102641499A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 步志高;陳偉業(yè);印春生
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司
• 主分類號: A61K39/155
• 分類號: A61K39/155;A61K39/135;A61K48/00;A61P31/14;C12N15/86;C12R1/93
• 代理公司: 北京市漢信律師事務(wù)所 11373
• 代理人: 王文生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)口蹄疫病毒VP1基因(編碼VP1蛋白)的重組小反芻獸疫病毒疫苗。本發(fā)明還公開了制備所述重組小反芻獸疫病毒疫苗的方法和該重組小反芻獸疫病毒疫苗在制備預(yù)防小反芻獸疫和/或口蹄疫的疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

小反芻獸疫(Peste?des?petits?ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste?des?petits?ruminants?virus，PPRV)引起的一種高度接觸性傳染性疾病[1](參見后文參考文獻(xiàn)列表)，嚴(yán)重危害山羊、綿羊、和野生小反芻獸[2]等動物，甚至曾經(jīng)引起水牛發(fā)病[3]。

PPRV的致死率為70-80％，在新的OIE分類中，被列為重要經(jīng)濟(jì)動物疾病，且疫情必須通報(bào)OIE。PPR長期以來一直在非洲、中東、中亞、南亞及東南亞地區(qū)危害流行，和我國西部接壤的巴基斯坦[4]、塔吉克斯坦[5]近些年都有流行爆發(fā)。2007年P(guān)PRV傳入我國西部邊境地區(qū)，導(dǎo)致局部疫情，對我國的畜牧養(yǎng)殖業(yè)形成嚴(yán)重威脅。我國山羊和綿羊的飼養(yǎng)量數(shù)以億計(jì)，但對于PPR的防控技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)不足，病原的研究和技術(shù)儲備缺乏，給我國的PPRV的防控帶來了極大的難度和挑戰(zhàn)，迫切需要我們抓緊PPRV疫苗研發(fā)、診斷技術(shù)、監(jiān)測、致病機(jī)制等研究，其中疫苗研發(fā)是重中之重。

PPRV屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)成員，與牛瘟病毒(Rinderpest?virus，RPV)同屬，基因組進(jìn)化與抗原性關(guān)系密切，具有共同的中和抗體表位。PPRV為單鏈負(fù)股RNA病毒，由15948個堿基組成，不分節(jié)段。病毒粒子內(nèi)主要含有6種結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和多聚酶大蛋白(L)。病毒囊膜表面的F和H蛋白為PPRV誘導(dǎo)中和抗體形成的主要免疫原，N蛋白不誘導(dǎo)中和抗體，但具有良好的免疫原性，是用于診斷的主要抗原[6-8]。

針對PPR最早使用的疫苗是牛瘟弱毒病毒(Rinderpest?Virus，RPV)，雖然能夠提供免疫保護(hù)，但不能夠產(chǎn)生PPRV的中和抗體[9]，后被經(jīng)Vero細(xì)胞傳代致弱的PPRV弱毒疫苗株(Nigeria75/1)所替代，后者能夠產(chǎn)生較高的PPRV的中和抗體，提供堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)力。

把PPRV免疫保護(hù)抗原(H和F蛋白)的基因重組至山羊痘病毒基因組，則構(gòu)建成PPRV重組山羊痘病毒疫苗[10-13]。以PPRV重組山羊痘病毒免疫山羊，不但能夠提供足夠的免疫保護(hù)抵抗PPRV強(qiáng)毒的攻擊[10-13]，而且還可以利用PPRV?N蛋白作為抗原，很容易地分免疫感染和自然感染，不影響血清學(xué)監(jiān)測。本研究室采用我國分離的山羊痘病毒疫苗株，分別構(gòu)建成了PPRV?H和F基因重組山羊痘病毒疫苗，疫苗防山羊痘和PPRV兩種疾病，為我國的PPR的防控提供了一種重要的選擇[12，13]。但PPRV重組痘病毒疫苗由于采用皮內(nèi)注射和兩次免疫程序[12，13]，勞動強(qiáng)度大，是其一大缺憾。

口蹄疫(foot?and?mouth?disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot?and?mouth?disease?virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性人畜共患傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的疾病。該病傳播途徑多，傳播速度快，在世界范圍內(nèi)曾多次發(fā)生流行，給各國造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

口蹄疫病毒(Foot?and?mouth?disease?virus，F(xiàn)MDV)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員，共有A、O、C、Asia?1、SAT1、SAT2和SAT37個血清型，型與型之間不能產(chǎn)生交叉保護(hù)，且從臨床癥狀上無法區(qū)別FMDV的血清型，這給疫苗免疫、診斷和防控帶來困難。FMDV基因組為單股正鏈RNA，約有8.5kb。基因組的中部是一個大的開放閱讀框(ORF)，編碼病毒的多聚蛋白，該聚蛋白經(jīng)裂解后形成L前導(dǎo)蛋白、P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白、P2區(qū)和P3區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白。FMDV?P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白最終成熟裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，這4種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成了FMDV衣殼，其抗原表位(antigenic?epitope)多位于衣殼蛋白上，決定著病毒的抗原性。