[發明專利]檢測樣品中的甲基化DNA的方法

有效

• 申請號: 201210055737.4
• 申請日: 2012-02-28
• 公開（公告）號: CN102653787A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 酒井綾子;梶田昌裕
• 申請（專利權）人: 希森美康株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

【技術領域】

本發明涉及從含DNA的樣品檢測甲基化DNA的方法。

【背景技術】

高等真核生物的染色體DNA中已知構成DNA的堿基之中C(胞嘧啶)的5位被甲基化。這樣的DNA的甲基化作為基因表達的控制結構發揮功能。例如，在某基因的啟動子區域存在的富含CpG序列的區域(也稱為“CpG島”或“CG島”)被甲基化時，其基因的轉錄被抑制。此現象也稱為“基因的沉默”。對此，當CpG島不被甲基化時，由于轉錄因子可結合到啟動子，從而基因的轉錄變得可能。

如上所述，DNA的甲基化是基因表達的控制結構之一。即，DNA的甲基化在初期胚發生、組織特異性的基因的表達、作為哺乳動物中特征性的現象的基因印跡及X染色體的失活、染色體的穩定化、DNA復制之時機等各種各樣的生理的及病理性的現象中實現重要的作用。再者近年明白，DNA的甲基化的異常、即，由DNA的甲基化所致的基因的沉默，與癌等的疾病相關。因此，對于各種的基因檢測甲基化DNA的重要性近年越發增加。

檢測甲基化DNA的方法在所述技術中已知各種方法，可例舉例如亞硫酸氫鹽測序法、使用甲基化感受性限制酶的方法、使用甲基化DNA免疫沉降的方法(MeDIP法)等。亞硫酸氫鹽測序法是通過亞硫酸氫鹽的作用將DNA中的非甲基化胞嘧啶變換為尿嘧啶，通過確定堿基序列，檢測DNA中的被甲基化的部位。使用甲基化感受性限制酶的方法是利用甲基化感受性限制酶不可切斷被甲基化的識別序列的特點，通過檢查其切斷結果來檢測甲基化DNA。MeDIP法是使用特異性地識別甲基化DNA的抗體或甲基化DNA結合蛋白質來進行免疫沉降，通過將得到的甲基化DNA供于微陣列解析等來檢測甲基化DNA。再有，此方法也被稱為MeDIP-Chip法。

在特開2008-263961號公報中公開了在使用甲基化感受性限制酶的檢測甲基化DNA的方法中，使用抗甲基化DNA抗體將樣品中的甲基化DNA固定到固相，用甲基化感受性限制酶進行消化處理的方法。

如此，甲基化DNA的檢測的重要性增加，期望新的檢測甲基化DNA的方法的開發。

【發明內容】

本發明的范圍僅由隨附的權利要求定義，且不以任何程度受此發明內容部分的影響。

本發明旨在提供用于檢測樣品中的甲基化DNA的新的方法。

本發明人驚人地發現，通過使可結合到甲基化DNA的蛋白質和甲基化DNA結合，該甲基化DNA不被脫氧核糖核酸酶完全地分解而殘留，再者得到的脫氧核糖核酸酶分解產物不給檢測步驟帶來影響，從而完成本發明。

即，本發明是：

(1)檢測樣品中的甲基化DNA的方法，其包括：

使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結合的蛋白質接觸，從而使上述樣品中的甲基化DNA和上述蛋白質結合；

使通過上述結合步驟得到的樣品和至少1種脫氧核糖核酸酶接觸，而將上述樣品中的DNA分解；及

在通過上述分解步驟得到的樣品中，通過與上述蛋白質的結合來檢測不被上述脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA；其中

上述脫氧核糖核酸酶的至少1種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。

(2)(1)所述的方法，其中

上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是抗甲基化DNA抗體或甲基化DNA結合蛋白質。

(3)(1)所述的方法，其中

上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是抗甲基化DNA抗體。

(4)(1)所述的方法，其中

上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是選自下列的至少1種甲基化DNA結合蛋白質：MBD1、MBD2、MBD4及MeCP2。

(5)(1)～(4)之任一項所述的方法，其中

上述樣品是由培養細胞株或從活體采集的血液、體液、組織或細胞制備的樣品。

(6)(1)～(4)之任一項所述的方法，其中

上述脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少1種：脫氧核糖核酸酶I、外切核酸酶I、λ-外切核酸酶、T7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、綠豆核酸酶、微球菌-核酸酶及T7內切核酸酶。

(7)(1)～(4)之任一項所述的方法，其中

上述樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品，

在檢測上述甲基化DNA的步驟中，檢測單鏈甲基化DNA。

(8)(1)～(4)之任一項所述的方法，其中