[發明專利]一種針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體及其制備

無效

• 申請號: 201210055624.4
• 申請日: 2012-03-06
• 公開（公告）號: CN102604994A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 黨寧寧;逄曙光;馬曉麗;邊紅;初晶學
• 申請（專利權）人: 黨寧寧
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 馮鐵惠

技術領域

本發明屬分子生物學，生物醫藥及基因工程技術領域，主要涉及針對絲聚合蛋白(filaggrin，FLG)基因的RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-FLG)及其制備。

背景技術

特應性皮炎(atopic?dermatitis，AD)，是一種與遺傳有關的，復雜的、瘙癢性、慢性炎癥性皮膚病。AD的病因和發病機制復雜，缺乏特效的治療手段，嚴重影響嬰幼兒及成年人的生活質量。目前認為AD的特征性臨床表現是易感基因、環境因素、有缺陷的皮膚屏障功能、免疫學異常共同相互作用的結果。近年來，遺傳學在AD的發病機理中的作用成為研究熱點。有關的易感區域研究近年來取得了一定程度的進展。近來，很多研究發現絲聚合蛋白基因(filaggrin?gene，FLG)突變和AD的發病有關。在有關尋常型魚鱗病(IV)的基因研究中，表皮分化復合物(EDC)的染色體1q21已經被確認，并描繪出幾個IV家系的在染色體1q21上的表皮分化復合物的繪制圖，強化了FLG可能是一個有潛在突變的可能致病的候補基因這一觀點。在此基礎上，2006年歐洲科學家發現FLG與AD發病的相關性，FLG也是AD的一個易感基因。并在今后的研究中得以證實。

絲聚合蛋白(filaggrin，FLG)是哺乳動物表皮細胞分化終末階段產生的一種陽離子蛋白，1993年由Simon等首先成功通過人表皮分離并部分純化，它與角蛋白等相互作用，構成真核細胞骨架。人類絲聚合蛋白的編碼基因FLG位于1q21，包含3個外顯子，其中exon1(15bp)和exon2(159bp)均不編碼蛋白質，exon3(12753bp)編碼大部分的重復序列和N-末端，主要由10～12個長約1kb的絲聚合蛋白重復序列組成，這些重復序列的相似性接近100％。絲聚合蛋白是皮膚表皮角質層的角質包膜(CE)的一個重要的組成蛋白，CE是形成表皮機械性防御屏障的基礎，因此filagghn表達的缺失和減少和皮膚干燥有關。它將會影響角質層的滲透作用，導致角質層含水量的下降，同時也影響阻止水分丟失的能力，引起表皮水分丟失量的增加，引起皮膚干燥。Filaggrin在表皮屏障功能中起著重要作用，也是AD皮膚屏障功能異常的主要原因之一。近年來很多研究者研究了FLG編碼突變引起角質層屏障功能缺失與AD之間的聯系。FLG基因突變引起的皮膚屏障功能障礙在AD發病中扮演著重要角色，然而FLG基因突變具有種族及地域差別。R501X、2282del4、R2447X、S3247X和3702delG是歐洲AD人群FLG基因的主要突變位點；而在日本AD人群中，S2554X、3321delA、S2889X和S3296X為其主要的易感位點；而香港的一項關于中國AD人群FLG的研究只在4例男性患者中發現R501X突變。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)技術是抑制基因表達的常用手段，又叫基因沉默。RNA干擾的原理是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默的現象。

RNA干擾過程主要有兩個步驟：一、雙鏈RNA被細胞源性雙鏈RNA特異性的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，即小干擾RNA(smallinterference?RNA，siRNA)；二、siRNA的反義鏈與核酸酶形成了沉默復合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)，該復合體具有識別結合與小干擾RNA有同源序列的mRNA，并在特異位點將該mRNA切斷。RNA干擾技術目前在基因治療及研究中得到了廣泛的應用，同時那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身可以進一步開發成為RNAi藥物。shRNA(shorthairpin?RNA)即短發夾RNA包含兩個短反向重復序列，其中一個與目的基因互補，中間loop序列分隔組成發夾結構。在體內shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表達。但是要將該技術應用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達持續及表達效率等重要問題。