[發明專利]一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法

無效

• 申請號: 201210052751.9
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN103255117A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 劉愛驊;祁環;梁波;白罰利
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及蛋白純化技術，具體的說是一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法。

背景技術

木質纖維素是世界上最豐富、最廉價的可再生資源，包括甘蔗渣、秸稈、玉米芯等。降解為單糖，發酵生產燃料乙醇被看做是對其最有效的利用方式之一。降低燃料乙醇的生產成本成為其發展的核心部分。到目前為止，許多策略都已經開發出來，其中以纖維素酶等為中心，旨在研發高效地木質纖維素糖化催化劑無疑是最有效的策略之一。

隨著技術的進步，越來越多參與木質纖維素降解的基因及相對應的水解酶，被分離和純化出來。其中來自里氏木霉(Trichoderma?reesei)的多糖水解酶系復雜而完整，能夠高效地降解木質纖維素為單糖。分離、純化其中的各種組分，是研究其酶學性質，研發高效酶制劑的基礎和前提。遺憾的是，關于這些酶組份的分離純化，大都需要復雜的層析步驟或者只能分離其中的一類組份，如纖維素酶、β-木糖苷酶等，這不能滿足協同性等，尤其是纖維素酶與木聚糖酶間協同性研究的需要。

發明內容

本發明的目在于提供一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法。

為實現上述目的本發明采用的技術方案為：

一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，將里氏木霉粗酶制劑溶解于20mM?Tris-HCl，pH7.0緩沖液中，以0.5M?NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下，使用Mono?Q^TM5/50GL陰離子交換柱進行梯度分離，根據紫外吸收峰分別收集11.5-65.5min，70.5-75.7min，75.7-81.0min，81.0-102.5min對應的洗脫組份，即為多糖水解酶，并分別將上述收集組分進一步的純化，

將根據紫外吸收峰收集11.5-65.5min組分凍干后，溶于0.5-1mL超純水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝膠過濾柱Superdex?75pg層析，收集51.5-55.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶II(CBH?II)；收集58.5-63.5min對應的洗脫組份，即為內切葡聚糖酶II(EG?II)；

將根據紫外吸收峰收集70.5-75.7min組分凍干后，溶于0.5-1mL超純水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝膠過濾柱Superdex?75pg層析，收集47.5-51.0min對應的洗脫組份，即為木聚糖酶；收集53.0-61.5min對應的洗脫組份，即為內切葡聚糖酶I(EG?I)；

將根據紫外吸收峰收集75.7-81.0min凍干后，溶于0.5-1mL超純水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝膠過濾柱Superdex?200pg層析，收集68.5-74.5min對應的洗脫組份，即為β-木糖苷酶；收集77.0-82.5min對應的洗脫組份，即為β-葡萄糖苷酶(BGL)；

將根據紫外吸收峰收集81.0-102.5min凍干后，溶于0.5-1mL超純水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝膠過濾柱Superdex?75pg層析，收集52.5-62.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶I(CBH?I)。

將所述Mono?Q^TM?5/50GL陰離子交換柱以0.8-1.2mL/min的流速，使用20mM?Tris-HCl，pH7.0緩沖液預平衡，待用。將所述凝膠過濾柱Superdex?75pg和凝膠過濾柱Superdex?200pg，以0.9-1.1mL/min的流速，使用TBS預平衡，待用。所述TBS為50mM?Tris-HCl?pH?7.5，150mM?NaCl。所述將里氏木霉粗酶制劑為將里氏木霉培養于以1％水葫蘆為唯一碳源的培養基中，而后采用飽和硫酸銨沉淀收集20％-60％飽和度得到沉淀，待用。所述1％水葫蘆為唯一碳源的培養基成分：Mandel培養基中添加1％的水葫蘆作為唯一碳源。

本發明所具有的優點：本發明從粗酶混合物中分離多種單一酶組份方法簡便，且得到較多水解酶組份，所純化得到的七種單一酶組份均保持有活性

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的純化七種來自里氏木霉的多糖水解酶的具體流程圖。

圖2為本發明實施例提供的經陰離子交換層析后得到的洗脫圖譜。

圖3為本發明實施例提供的經凝膠過濾層析后得到的洗脫圖譜。

本發明的目的、優點將結合實施例，參照附圖、表進一步說明。

具體實施方式

本發明給出詳細具體的分離純化方法參見流程見圖1。