[發明專利]一種分泌抗菌肽的乳酸鏈球菌基因工程制備方法與應用

在審

• 申請號: 201210051654.8
• 申請日: 2012-03-01
• 公開（公告）號: CN103289944A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 張捷;鄭文官;潘韻;彭永鶴;李永新
• 申請（專利權）人: 深圳市圣西馬生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/29;C12N15/74;C07K14/415;A23K1/17;A23L1/29;A61K38/16;A61P31/00;C12R1/46
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技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體地說涉及一種重組抗菌肽，其基因工程乳酸鏈球菌的制備和應用。

背景技術

由于人類對抗生素的過度濫用，藥物殘留和細菌耐藥性等問題日益嚴重，不斷困擾著畜牧養殖業并引發食品安全問題。

抗菌肽是生物體內在防御外源病原體入侵時產生的小分子多肽，廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內，除具有廣譜抗細菌、真菌和病毒等病原體作用外，還有抗腫瘤細胞作用和免疫調節作用，在醫藥衛生、農業生產、食品工業等領域具有廣泛的應用前景?？咕淖饔脵C制獨特，不易產生耐藥菌，被認為是傳統抗生素替代品。

目前，國內外宣傳的抗菌肽制備方式多種多樣，有人用利用大腸桿菌、病毒、酵母、植物細胞、昆蟲和哺乳動物細胞等重組表達系統來表達抗菌肽(專利ZL96100376.6和專利ZL200810132258.1；天蠶抗菌肽AD基因在AcNPV載體系統中的表達研究，黃亞東，中國抗生素雜志，28：304-307，2003)。這些表達系統本身也有不足：抗菌肽自身對病原菌具有抑制和殺滅作用，這就難以用原核生物中的大腸桿菌做為表達系統；使用病毒表達系統存在實驗步驟繁瑣，條件不易控制；抗菌肽對真核細胞沒有抑制作用，但多細胞真核表達系統具有生產周期長，生產成本高的缺點。這些都很難實現大規模的工業生產。酵母表達系統作為單細胞真核表達系統，遺傳背景清楚，被應用于工業生產，常被應用的酵母有畢赤酵母和釀酒酵母。

但是，畢赤酵母并不是常見的食用菌，這就限制了其廣泛的應用；釀酒酵母是食用菌，但不是動物機體內的天然益生菌群，而乳酸菌在自然界和人畜消化系統中廣泛存在，目前發現200多種，其中絕大部分都存在于人體及動物的腸道，是機體必不可少且具有重要生理功能的菌群。市面上也不缺乏動物用乳酸菌制品，它們主要的功用在于促進免疫調節，增強機體對腸道感染的抵抗能力，減少腹瀉。

總之，制備分泌其他物種來源的抗菌肽的乳酸鏈球菌，不僅可以得到高效的抗腫瘤、抗炎癥、調節免疫功能的保健型產品，而且能夠達到綠色無殘留，安全可靠的標準，易應用于大規模生產，并可以從源頭上解決濫用抗生素給養殖業、生態環境和人類健康帶來的嚴峻問題，有效解決當前抗生素引起的食品安全和污染問題

發明內容

本發明旨在提供一種分泌抗菌肽的基因工程乳酸鏈球菌的制備方法，該方法獲得的乳酸菌與抗菌肽復合產品，成本低，具有高效活性，易于實現產業化。

本發明所述的一種分泌抗菌肽的基因工程乳酸鏈球菌的制備方法，其操作步驟為：

1)：抗菌肽的基因擴增

設計合成上下游引物，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位點，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位點，以AMP的重組質粒為模板，通過PCR擴增，獲得抗菌肽基因片段；或者直接合成已知的抗菌肽cDNA序列，再通過PCR擴增獲得抗菌肽基因片段；再或者從生物組織或細胞中提取RNA進行RT-PCR擴增獲得抗菌肽基因片段。

2)：抗菌肽的基因克隆和測定

將抗菌肽基因擴增后，回收PCR產物，用T4連接酶與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經抗性培養基篩選、測序后，獲得最終獲得陽性重組質粒pMD18-T：AMP。

3)：乳酸鏈球菌表達載體的構建和轉化

擴大培養陽性轉化子并抽提重組pMD18-T：AMP質粒，分別用限制性內切酶XbaI和HindIII雙酶切重組質粒和乳酸鏈球菌穿梭質粒pAR1411。回收酶切產物，用T₄DNA連接酶連接，構建重組表達質粒pAR1411：AMP，用電轉的方法轉入乳酸鏈球菌L.lactis?subsp.cremoris?MG1363，通過抗性培養基(GM17+0.5M瓊脂，紅霉素)篩選陽性轉化子MG1363/AMP。

其表達框為P32-AMP-TT，其中P32為啟動子，TT是終止子。

4)：重組乳酸鏈球菌工程菌擴大培養和抗菌肽的鑒定

將篩選的陽性轉化子MG1363/AMP，在GM17液體培養基中擴大培養，24-48h后，收集菌液，離心取上清，濃縮，然后Tricine-SDS-PAGE鑒定抗菌肽蛋白的表達情況；并且進行抗菌肽的抗菌活性測定。

本發明的有益效果在于：

1.本發明所采用的表達系統安全，表達量高，穩定性好。表達的抗菌肽為組成型分泌表達，細胞培養過程無需額外添加有毒誘導劑，綠色安全；