[發(fā)明專利]一種分泌抗菌肽的乳酸鏈球菌基因工程制備方法與應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201210051654.8
• 申請日: 2012-03-01
• 公開（公告）號: CN103289944A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張捷;鄭文官;潘韻;彭永鶴;李永新
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/29;C12N15/74;C07K14/415;A23K1/17;A23L1/29;A61K38/16;A61P31/00;C12R1/46
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1.分泌抗菌肽(AMP)的乳酸鏈球菌以及產(chǎn)物的制備方法，其特征在于其操作步驟為：

(1)抗菌肽的基因擴增；

(2)抗菌肽的基因克隆和測定；

(3)乳酸鏈球菌表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化：

(4)重組乳酸鏈球菌工程菌擴大培養(yǎng)和抗菌肽的鑒定。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在乳酸鏈球菌表達載體的多克隆位點間插入抗菌肽基因，其表達框為P32-AMP-TT，其中P32為啟動子，TT是終止子。

3.如權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于步驟(1)中，設(shè)計合成上下游引物，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位點，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位點，以AMP的重組質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增，獲得抗菌肽基因片段；或者直接合成已知的抗菌肽cDNA序列，再通過PCR擴增獲得抗菌肽基因片段；再或者從生物組織或細胞中提取RNA進行RT-PCR擴增獲得抗菌肽基因片段。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中抗菌肽的克隆和測定包括以下步驟：將抗菌肽基因擴增后，回收PCR產(chǎn)物，用T4連接酶與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選、測序后，最終獲得陽性重組質(zhì)粒pMD18-T：AMP。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中構(gòu)建和轉(zhuǎn)化的步驟為：擴大培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子并抽提重組pMD18-T：AMP質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒和乳酸鏈球菌穿梭質(zhì)粒pAR1411，回收酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pAR1411：AMP，用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入乳酸鏈球菌L.lactis?subsp.cremoris?MG1363，獲得陽性轉(zhuǎn)化子MG1363/AMP，通過抗性培養(yǎng)基(GM17+0.5M瓊脂，紅霉素)篩選陽性轉(zhuǎn)化子MG1363/AMP。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中工程菌的擴大培養(yǎng)和表達產(chǎn)物鑒定，具體步驟為：將篩選的陽性轉(zhuǎn)化子MG1363/AMP，在GM17液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，24-48h后，收集菌液，離心取上清，濃縮，然后Tricine-SDS-PAGE鑒定抗菌肽蛋白的表達情況；并且進行抗菌肽的抗菌活性測定。

7.權(quán)利要求4～7任選-項的方法在生產(chǎn)制備飼料添加劑、食品、醫(yī)藥產(chǎn)品中的應(yīng)用。