[發(fā)明專利]中國鱟素組成型酵母表達載體及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210051429.4
• 申請日: 2012-03-01
• 公開（公告）號: CN103233035A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設計）人: 韓文瑜;馮新;雷連成;宋戰(zhàn)昀;刁昱文;趙紅蕾;高宇
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域。?

背景技術

抗菌肽（Antibacterial?Peptides，ABP）是由胚系基因編碼的內源性活性肽分子，廣泛存在于多種生物體內，是生物體對外界病原物入侵感染而產生的一系列免疫反應的產物。由于其分子量小，極易擴散到感染部位，不存在使用后產生耐藥性的問題，且進入機體后無有害殘留，因此，抗菌肽在畜禽養(yǎng)殖業(yè)上的研究與應用，將是實現健康養(yǎng)殖、消除抗生素殘留的重要措施。鱟是一種極其珍貴的海洋無脊椎動物，也是海洋動物界現存的“活化石”，其經濟價值和科研價值很高。鱟缺乏獲得性免疫系統，在抵抗病原侵襲的過程中形成了多種天然防御系統，在這些防御系統中，鱟素（Tachyplesin）發(fā)揮了主要的抗病原作用。鱟素是一類存在于鱟血細胞中的具有抗菌活性的陽離子多肽，它的發(fā)現被醫(yī)學界稱為“抗生素”研究的一個里程碑，是后抗生素時代到來的標致。?

1969年，Koichi?Ogata首次發(fā)現了一種可以利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌^[?]。甲醇可以很廉價的從天然氣中合成，因此立即引起人們將畢赤酵母開發(fā)成動物高蛋白飼料的興趣。20世紀70年代，Phillips?Petroleum?Company研制了畢赤酵母單細胞蛋白（SCP）的培養(yǎng)基及連續(xù)高密度培養(yǎng)方法（<130?g/L?細胞干重）。進入80年代，Salk?Institute?Biotechnology/Industrial?Associate?Inc.（SIBIA）將畢赤酵母開發(fā)為異源蛋白表達系統，并構建了載體、菌株及畢赤酵母的基因工程操作方法。沿用SCP生產中使用的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，聯合AOX1啟動子的調控，實現了外源蛋白在畢赤酵母中的高水平表達。1993年，授權Invitrogen?Company向全世界出售該系統，推動了畢赤酵母表達系統的發(fā)展和應用。到目前，已用畢赤酵母表達系統成功的表達了200種以上的蛋白，畢赤酵母還被美國食品和醫(yī)藥管理局（Food?and?Drug?Administration，FDA）確認為是一種安全的生物，具有良好的生物安全性。1997年開發(fā)的P.pastoris的組成型甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceraldehydes–3-phosphate?dehydrogenase，GAP）啟動子，該啟動子是組成型表達的，所以不存在誘導的問題，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上就可以表達，從而有利于產品的生產和應用，且表達量較誘導型高。目前，該系統還很少應用于抗菌肽的表達，預期將該系統引入抗菌肽的表達，能夠成為抗菌肽規(guī)模化生產的最佳途徑。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是采用微生態(tài)理論和分子生物學技術，將中國鱟抗菌肽Tachyplesins?I（TP?I）基因克隆到組成型表達載體pGAPZα?A中，構建鱟素抗菌肽基因GAP啟動子酵母表達載體。?

本發(fā)明首先根據tachyplesins基因的測序結果設計引物TP?I-NNX1和TP?I-NNX2，含如下酶切位點：?

上游引物TP?I-NNX1：5’-CCGC|TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3’

Xho?I

下游引物TP?I-NCX2：5’-GCT|CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3’

Xba?I

然后根據pGAPZα使用手冊合成通用引物：

上游引物5’?pGAP：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

下游引物3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

對TP?I基因的克隆質粒pMD-18T-TP?I和酵母表達載體pGAPZα?A進行雙酶切，回收酶切目的片段，用T₄?DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性轉化子，提取質粒，進行PCR和雙酶切鑒定，并進行測序。

本發(fā)明由上述方法獲得的中國鱟素組成型酵母表達載體pGAPZα?A-TPI。?