[發明專利]一種Oligo dT引物及構建cDNA文庫的方法

有效

• 申請號: 201210047909.3
• 申請日: 2012-02-28
• 公開（公告）號: CN102533752A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B40/08;C40B50/06;C12N15/10
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技術領域

本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種Oligo?dT引物，以及基于這種Oligo?dT引物進行cDNA文庫構建的方法。?

背景技術

基因表達水平的分析，對研究基因功能起著至關重要的作用。基因表達序列分析(serial?analysis?of?gene?expression，SAGE)，是一種快速分析基因表達信息的技術，它通過快速和詳細分析成千上萬個表達序列標簽(Expressed?Sequenced?Tags，EST)來尋找出表達豐度不同的SAGE標簽序列，從而接近完整地獲得基因組表達信息。SAGE技術與基因芯片一起為目前兩種最常見的基因表達譜研究方法。隨著第二代測序技術的發展，通過構建cDNA文庫，然后利用第二代測序技術的高通量優勢對mRNA文庫進行測序，進而進行基因表達譜分析的方法在基因表達譜研究中占有越來越重要的地位。?

真核生物的mRNA分子的5’端存在帽子結構，且往往還含有二級結構，因此，若要成功構建5’端cDNA文庫(該文庫中各分子攜帶的待測標簽來源于5’各mRNA分子的5’端)，必須克服5’端帽子結構和5’端存在的二級結構的影響，難度較大。此外，即使得到5’端cDNA文庫，因為mRNA分子5’端GC含量較高，該文庫中各分子攜帶的待測標簽與各mRNA分子的對應關系較差，使得這種文庫在多種科學研究中的應用難度較高，用于mRNA分子的表達譜分析時得到的結果不準確。還有，構建所得的5’端cDNA文庫5’未端表現不足(undellrepresentation)是目前技術的固有限制，且由許多因素引起。其中最重要的一種因素是由逆轉錄酶的延長過程的隨機失效引起的。因為逆轉錄酶從mRNA的3’移動到5’末端，所以一定百分比的逆轉錄酶可能從刪RNA模板解離，從而引起cDNA合成過早終止。另一種起作用的因素是逆轉錄酶在mRNA二級結構區域暫停、減緩或停止。還有一種因素是由污染性的RNA酶引入的，如果在由mRNA分子逆轉錄成雙鏈cDNA分子的過程中，有極微量的污染性RNA酶，那么，部分mRNA分子的5’未端會被污染性的RNA酶降解去除。上述情況對長mRNA分子的影響尤其嚴重。因此，目前構建cDNA文庫的現有技術中，構建3’端cDNA文庫是主流。而現有技術中常采用的Oligo?dT引物為含有連續的dT序列的單鏈DNA分子，序列可簡寫為：5’-(dT)_n-3’，在整個文庫的構建過程中僅具有分離純化mRNA分子，將mRNA分子反轉錄成雙鏈cDNA的作用，對形成雙鏈cDNA后的后續操作限制較大，能應用的建庫方法?單一。?

目前，構建3’端cDNA文庫的方法大致如下：?

(1)利用Oligo?dT引物將mRNA反轉錄并合成dscDNA；?

(2)錨定酶(anchoring?enzyme，AE)NlaIII酶切dscDNA，收集dscDNA的poly?A/T部分與最近的酶切位點之間的片段，得3’-cDNA；?

(3)在3’-cDNA的5’端接上接頭1，得含有接頭1的cDNA，該接頭1為雙鏈DNA分子，包含Mme?I酶切識別序列，其3’端含有CATG四堿基突出末端；?

(4)Mme?I酶切合有接頭1的cDNA，并回收含有接頭1的酶切產物；?

(5)在含有接頭1的酶切產物的3’端接上接頭2，從而獲得兩端連有不同接頭序列的cDNA文庫，該接頭2為雙鏈DNA分子，其5’端為突出末端，含有兩個通用堿基。?

上述方法中的錨定酶為序列特異性的限制性內切酶，當某些mRNA分子上無該錨定酶的酶切位點時，這些mRNA分子在最終的cDNA文庫中無法體現；又或者某些mRNA分子上錨定酶的酶切位點不合適，使得后續的IIs型限制性內切酶Mme?I無法實現酶切，或者實現Mme?I酶切的位置在dscDNA的poly?A/T部分，使得這些mRNA分子所形成的cDNA文庫分子中包含的特異性序列太短，無法實現與這些mRNA分子特異性的對應。即，上述方法無法保證樣品中所有的mRNA分子均能在cDNA文庫中得到體現，進而使得后續的基因表達譜分析結果不準確。?

因此需要一種新的Oligo?dT引物，該引物適用性廣，基于該引物形成的雙鏈cDNA分子對后續操作的限制小，能夠應用于多種建庫方法中；此外還需要一種新的cDNA文庫構建方法，該cDNA文庫構建方法能夠使樣品中所有的mRNA分子在構建的cDNA文庫中得到特異性的體現。?

發明內容