[發明專利]一種Oligo dT引物及構建cDNA文庫的方法

有效

• 申請號: 201210047909.3
• 申請日: 2012-02-28
• 公開（公告）號: CN102533752A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B40/08;C40B50/06;C12N15/10
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1.一種Oligo?dT引物，其特征在于，所述Oligo?dT引物為含有連續的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點。

2.根據權利要求1所述的Oligo?dT引物，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或II?s型限制性內切酶識別序列，所述IIs型限制性內切酶識別序列在Oligo?dT引物的5’端。

3.根據權利要求2所述的Oligo?dT引物，其特征在于，所述Oligo?dT引物序列為：

5’-(dT)_xU(dT)_y-3’；

或5’-(RERS)-(dT)_z-3’；

或5’-(dT)_α(P-S)(dT)_β-3’；

或5’-(dT)_γ(I)(dT)_δ-3’；

其中，x、y、z、α、β、γ、δ均為自然數，RERS為含有IIs型限制性內切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。

4.根據權利要求2所述的Oligo?dT引物，其特征在于，所述Oligo?dT引物的3’末端為含通用堿基的核苷酸M，M為A或G或C。

5.根據權利要求4所述的Oligo?dT引物，其特征在于，所述Oligo?dT引物的3’末端為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至3’端依次為M和N，N為A或G或C或T或U或I；所述Oligo?dT引物序列為：

5’-(dT)_xU(dT)_yMN-3’；

或5’-(RERS)-(dT)_zMN-3’；

或5’-(dT)_α(P-S)(dT)_βMN-3’；

或5’-(dT)_γ(I)(dT)_δMN-3’；

其中，x、y、z、α、β、γ、δ均為自然數，RERS為含有IIs型限制性內切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。

6.根據權利要求1至5中任一項所述的Oligo?dT引物，其特征在于，所述Oligo?dT引物含有標記物，所述標記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種。

7.一種cDNA文庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.利用Oligo?dT引物反轉錄mRNA，形成第一條cDNA鏈，得RNA/DNA雜合分子；該Oligo?dT引物為含有連續的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點；

B.對RNA/DNA雜合分子中的第一條cDNA鏈進行擴增，得雙鏈cDNA；

C.利用IIs型限制性內切酶酶切雙鏈cDNA，得含mRNA分子3’端對應序列的片段；

D.含mRNA分子3’端對應序列的片段與第一接頭分子連接，得cDNA文庫。

8.根據權利要求7所述的cDNA文庫構建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或IIs型限制性內切酶識別序列，所述IIs型限制性內切酶識別序列在Oligo?dT引物的5’端。

9.根據權利要求8所述的cDNA文庫構建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷；所述步驟C包括以下步驟：

C01.切割劑切割雙鏈cDNA，得雙鏈切割片段；

C02.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產物；

C03.利用第一IIs型限制性內切酶酶切第一連接產物，得含mRNA分子3’端對應序列的片段；

所述切割劑用于特異性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷3’端的第二個磷酸二酯鍵。