[發明專利]檢測結核分枝桿菌分泌蛋白的免疫層析試紙及其制備方法

無效

• 申請號: 201210045227.9
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102621318A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 徐寧;姚航平
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于臨床微生物快速檢測的免疫層析技術領域，特別是涉及一種利用抗CFP-10蛋白抗體相關的免疫層析顯色來早期鑒定培養物中結核分枝桿菌的方法。

背景技術

據世界衛生組織統計，全球已有近1/3的人口感染了結核分枝桿菌，在某些發展中國家成人中結核分枝桿菌攜帶率高達80％，其中約5％-10％攜帶者可發展為活動性結核病。我國結核病人數居全球第二位，每年死于結核病的人是各類傳染病死亡人數總和的兩倍多。近二十年由于艾滋病的流行，感染了人類免疫缺陷病毒(HIV)的結核分枝桿菌攜帶者發展為活動性結核病的可能性比未感染HIV者高30-50倍。結核病又成為了威脅人類健康的全球性衛生問題，更是影響我國發展的重大社會和經濟問題。

結核病的實驗室診斷主要依賴細菌學涂片和培養檢查。由于方法所限，嚴重影響了結核病的及時診斷。因此，多年來國內外學者一直在尋找快速、敏感、特異、簡便的實驗室診斷方法。

結核分枝桿菌培養分離是目前結核病診斷的金標準，但使用普通羅氏培養基需要4-8周時間，改良酸性羅-瓊氏培養平均也需要25天，無法充分滿足臨床快速診斷的需要。針對結核分枝桿菌的快速培養，目前出現了各種改良的液體培養基和自動培養系統(馬俊，王自立.結核分枝桿菌快速培養的研究進展及其臨床意義[J].中國脊柱脊髓雜志，2007，17(5).388-390)。液體變色培養基最先由德國Heipha/Biotest公司研制，稱為MBRedox系統；自動培養系統包括以Bactec?MGIT?960為代表的第二代分枝桿菌快速培養、藥敏檢測系統以及BBL?MGIT分枝桿菌快速手工培養、鑒定、藥敏檢測系統等。不管是液體培養基還是自動培養系統，都還存在污染率高的問題，對于儀器判斷為陽性的樣品，仍須進行涂片、抗酸染色、顯微鏡下找到抗酸桿菌后方能判定陽性，費事費力。自動培養系統更由于儀器和試劑價格昂貴，難以得到普及。因此研究開發新一代結核分枝桿菌的快速檢測試劑非常必要。

結核分枝桿菌培養濾液蛋白10(CFP-10)是Berthet等鑒定出來的一種低分子量、高度特異性的分泌性蛋白(BehrM?A，Wilson?M?A，GillW?P，et?al.Comparative?genomics?of?BCG?vaccines?by?whole-genome?DNA?microarray[J].Science，1999，284(5419)：1520-1523.)，又名MTBb11、MTSA-10，位于結核分枝桿菌6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因的上游，由同一個操縱子和啟動子調節轉錄，屬于ESAT-6家族蛋白，兩者約40％的同源性，具有相同的免疫學特性。CFP-10存在于MTB的早期培養濾液里，僅分布于各型結核桿菌中，而BCG及其它非致病性分枝桿菌缺失。因此在診斷結核桿菌感染的過程中可以區別是結核分枝桿菌感染還是非致病性結核分支桿菌感染。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種使用簡便快捷、靈敏度和特異性高、適合于基層現場快速檢測培養物中結核分枝桿菌的免疫層析試紙。

為了解決上述問題，本發明提供一種快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙(雙抗體夾心法快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙)，包括上樣墊、含有金標記的抗CFP-10單克隆抗體TBCA6的膠體金墊、包被質控線和檢測線的硝酸纖維素膜吸樣墊以及以及支撐板；檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗CFP-10單克隆抗體TBCD6，質控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG抗體；在硝酸纖維素膜的上表面分別設置膠體金墊和吸樣墊，上樣墊位于膠體金墊的上表面，硝酸纖維素膜的下表面與支撐板緊密相連。

本發明還同時提供了上述免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟：

A、抗CFP-10單克隆抗體TBCD6和TBCA6的制備：

用于包被檢測線的抗CFP-10單克隆抗體TBCD6，能特異性識別CFP-10的aa?23-36GDLKTQIDQVESTA抗原肽序列，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNO：C201082；

用于膠體金墊中金標記的抗CFP-10單克隆抗體TBCA6，能特異性識別CFP-10的aa53-66AAVVRFQEAANKQK抗原肽序列，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO：C201083；

制備方法如下：