[發明專利]檢測結核分枝桿菌分泌蛋白的免疫層析試紙及其制備方法

無效

• 申請號: 201210045227.9
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102621318A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 徐寧;姚航平
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.一種快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙，其特征是：包括上樣墊(1)、含有金標記的抗CFP-10單克隆抗體TBCA6的膠體金墊(2)、包被質控線(3)和檢測線(6)的硝酸纖維素膜(5)、吸樣墊(4)以及支撐板(7)；所述檢測線(6)為包被在硝酸纖維素膜上的抗CFP-10單克隆抗體TBCD6，質控線(3)為包被在硝酸纖維素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗體；在硝酸纖維素膜(5)的上表面分別設置膠體金墊(2)和吸樣墊(4)，上樣墊(1)位于膠體金墊(2)的上表面，硝酸纖維素膜(5)的下表面與支撐板(7)固定相連。

2.如權利要求1所述的快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙的制備方法，其特征是包括以下步驟：

A、抗CFP-10單克隆抗體TBCD6和TBCA6的制備：

用于包被檢測線(6)的抗CFP-10單克隆抗體TBCD6，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO：C201082；

用于膠體金墊(2)中金標記的抗CFP-10單克隆抗體TBCA6，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO：C201083；

制備方法如下：

1)單抗腹水的誘導：在接種雜交瘤細胞前一周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接種5×10⁶TBCD6或TBCA6的陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹水離心，測定抗體效價；

2)TBCD6或TBCA6單克隆抗體的純化：利用Protein?G親和純化法分別純化腹水中的TBCD6或TBCA6單克隆抗體；

B、制作包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)；然后將包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)粘貼在支撐板(7)上；

包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)制作方法依次進行如下步驟：

1)、用0.01mol/L?PH7.4磷酸鹽PBS緩沖液將抗CFP-10單克隆抗體TBCD6配制成濃度為0.3mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜(5)的下表面以0.8～1.2ul/cm的參數劃線，包被成檢測線(6)；

2)、用0.01mol/L?PH7.4磷酸鹽PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體配制成2.4mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜(5)的上表面以0.8～1.2ul/cm的參數劃線，包被成質控線(3)；

3)將劃線后的硝酸纖維素膜(5)于36.5～37.5℃的溫度和小于30％的濕度的條件下干燥8～10小時；得包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)；

C、制備含有金標記的抗CFP-10單克隆抗體TBCA6的膠體金墊(2)：

將TBCA6單克隆抗體膠體金探針溶液加入至玻璃纖維膜或聚脂膜，干燥后，得膠體金墊(2)；將膠體金墊(2)粘貼在步驟B得到的硝酸纖維素膜(5)的上表面的左側；

所述TBCA6單克隆抗體膠體金探針溶液的制備方法如下：

1)、將質量濃度0.01％的HAuCL₄水溶液加熱煮沸，每50ml?HAuCL₄水溶液在100-110℃的磁力加熱攪拌下加入1.7～1.8ml的質量濃度1％的檸檬酸三鈉水溶液，于100-110℃繼續加熱攪拌8～12分鐘，得膠體金溶液；

2)、調節膠體金溶液至pH5.5，將抗體TBCA6按0.7～0.75mg抗體TBCA6/100ml膠體金溶液的比例偶聯，混勻后為TBCA6的免疫膠體金探針溶液；

3)、將上述TBCA6的免疫膠體金探針溶液4℃15000r/min離心30min后棄去上清，以重懸液重懸沉淀物，得TBCA6單克隆抗體膠體金探針溶液；所述重懸液是步驟2)的膠體金溶液體積的0.9～1.2倍；

所述重懸液的制備方法如下：在濃度為0.01mol/L，PH7.4的PB緩沖液一升中加入9～11g的BSA、33～37g的蔗糖和0.28～0.32g的PEG20000；

D、在步驟C所得的膠體金墊(2)的上表面粘貼上樣墊(1)；在硝酸纖維素膜(5)的上表面的右側搭接吸樣墊(4)，得快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙。

3.根據權利要求2所述的快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙的制備方法，其特征是所述步驟C中：將TBCA6單克隆抗體膠體金探針溶液按1ml溶液鋪23～27cm²的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或聚酯纖維膜上。