[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)3-甲基喹噁啉-2-羧酸的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210045175.5
• 申請(qǐng)日: 2012-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102585005A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁宗輝;張西亞;彭大鵬;王玉蓮;潘源虎;黃玲利;陳冬梅;陶燕飛;劉振利;周琪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/44
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 武漢開(kāi)元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 樊戎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種能識(shí)別3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的單克隆抗體和一種用于檢測(cè)3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)及試劑盒。

背景技術(shù)

喹乙醇是喹噁啉-N-1，4-二氧化物衍生物，化學(xué)名稱(chēng)是N-羥乙基-3-甲基-2-喹啉酰胺-1，4-二氧化物，具有抗菌促生長(zhǎng)作用，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。毒理學(xué)研究表明，喹乙醇具有致突變、致畸和致癌性，對(duì)人和動(dòng)物均能引起光敏反應(yīng)。食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(Joint?FAO/WHO?Expert?Committee?on?Food?Additives，JECFA)第36屆會(huì)議對(duì)喹乙醇的代謝途徑進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，給藥48小時(shí)后，約95％的藥物隨尿液和糞便排出體外，在8～20天，肌肉中MQCA的含量約占總殘留的25％。在此次會(huì)議上，JECFA規(guī)定MQCA為喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)代謝的殘留標(biāo)示物，在肌肉中的最高殘留限量(MRLs)為4μg/kg。我國(guó)規(guī)定喹乙醇?xì)埩魳?biāo)示物MQCA的最大殘留限量在豬肝臟為50μg/kg，肌肉為4μg/kg。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于動(dòng)物組織中MQCA的檢測(cè)方法很多，主要是高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器分析方法，關(guān)于免疫學(xué)檢測(cè)方法報(bào)道很少。Chen?W等(Chen?W，Jiang?Y，Zhu?C?Q，et?al.Automated?and?ultrasensitive?detection?of?methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic?acid?by?using?gold?nanoparticles?probes?SIA-rt-PCR.Biosensors?and?Bioelectronics，2009，24：2858-2863)報(bào)道了一種用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA聯(lián)合RT-PCR序列分析技術(shù)檢測(cè)MQCA的方法，該方法靈敏度很高，在2.5aM-250fM范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，最低定量限1.4aM，回收率89-108％，但是，該方法操作復(fù)雜，所需儀器設(shè)備成本較高。中國(guó)專(zhuān)利ZL?200610164836.0公開(kāi)了一種用于3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及試劑盒，該方法及試劑盒用3-甲基喹噁啉-2-羧酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到的免疫原免疫家兔得到特異性兔多克隆抗體，此抗體能特異性識(shí)別3-甲基喹噁啉-2-羧酸與苯胺的反應(yīng)產(chǎn)物，對(duì)3-甲基喹噁啉-2-羧酸原型并不能識(shí)別，因此，應(yīng)用該試劑盒進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，必須有一個(gè)樣品衍生的過(guò)程，大大增加了檢測(cè)時(shí)間和操作的復(fù)雜性，此外，該試劑盒使用的是兔多克隆抗體，不同批次的多克隆抗體的變異較大，不利于試劑盒的規(guī)模化生產(chǎn)與應(yīng)用。相對(duì)于多克隆抗體，單克隆抗體具有特異性好，靈敏度高，批間差異小，便于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

因此，制備出針對(duì)MQCA原型的特異性單克隆抗體，建立基于MQCA單克隆抗體的ELISA檢測(cè)方法及試劑盒具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能特異性識(shí)別MQCA的單克隆抗體。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，建立一種能檢測(cè)MQCA的酶聯(lián)免疫方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是研制適用于MQCA檢測(cè)的試劑盒。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在動(dòng)物組織3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種能識(shí)別MQCA的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC?NO：C201147的雜交瘤細(xì)胞MQCA?GA/5B10所分泌的。

上述雜交瘤細(xì)胞MQCA?GA/5B10，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC?NO：C201147。

所用的免疫原是由半抗原MQCA與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備得到的。

進(jìn)一步，本發(fā)明提出了一種適用于MQCA殘留檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法，該方法包括免疫原、包被原和抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)等步驟，具體如下：

(1)將半抗原MQCA與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原；

(2)將半抗原MQCA與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原；

(3)用步驟(1)的免疫原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCC?NO：C201147的雜交瘤細(xì)胞MQCA?GA/5B10；