[發(fā)明專利]建立胎盤間充質(zhì)干細胞庫的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210044638.6
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102586184A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 霍思維;陳俊峯;張毅;許曉椿;李詣書
• 申請（專利權(quán)）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0735;G06F19/28
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞從而建立胎盤間充質(zhì)干細胞

庫的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal?stem?cell，MSC)例如人類的間充質(zhì)干細胞最早是從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的一類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干細胞，在體內(nèi)和體外特定條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞、肝細胞等多種成體細胞分化的能力(Caplan?AI.Mesenchymal?stem?cells.J?Orthop?Res.1991，9：641-650.Pittenger?MF，Mackay?AM，Beck?SC，et?al.Multilineage?potential?of?adult?human?mesenchymal?stem?cells.Science.1999；284：143-147)。最新的研究表明間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用，而且易于外源基因?qū)氡磉_。因此間充質(zhì)干細胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構(gòu)建中的種子細胞，基因治療中重要的載體細胞，而且由于間充質(zhì)干細胞促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應(yīng)功能，在造血干細胞移植和器官移植中具有廣泛的應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細胞具有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經(jīng)成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞。

目前所報道的間充質(zhì)干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經(jīng)歷一個比較痛苦的手術(shù)，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機會；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每10⁵～10⁶個單個核細胞中大約只有1個，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質(zhì)干細胞的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用中受到限制。起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層的胎盤是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細胞，從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應(yīng)用開辟一個嶄新而豐富的來源。

現(xiàn)有的從胎盤中分離干細胞從而建立胎盤干細胞庫的方法尚有諸多缺點，例如純度不足、和/或數(shù)量不高，進而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如CN?101270349A(中國專利申請?zhí)?00810061267.6，公開日2008年9月24日)公開的題為“胎盤間充質(zhì)干細胞分離和體外擴增培養(yǎng)方法”的發(fā)明；CN?101693884A(中國專利申請?zhí)?00910117522.9，公開日2010年4月14日)公開的題為“一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細胞的方法”的發(fā)明；CN?102146359A(中國專利申請?zhí)?01110005964.1，公開日2011年8月10日)公開的題為“從胎盤中提取原始間充質(zhì)干細胞及無血清擴增的方法”的發(fā)明。這些方法在提取物的純度和/或回收率方面是有待進一步改善的。

本領(lǐng)域仍然需要有新的從胎盤中分離干細胞從而建立胎盤干細胞庫的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有獲取胎盤間充質(zhì)干細胞方法的缺陷，提供一種實用簡單的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細胞從而建立胎盤干細胞庫的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用特別的操作方法，所獲得的細胞純度高和/或細胞回收率高。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

因此，本發(fā)明第一方面提供一種建立胎盤間充質(zhì)干細胞庫的方法，該方法包括以下步驟：

(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；

(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37℃孵育消化；

(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時研磨以促使過濾；

(d)將收集的過濾液離心，分離單個核細胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，然后在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(e)待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞；

(f)針對步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細胞于液氮中凍存；

(h)建立包含以上信息的胎盤干細胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細胞進行關(guān)聯(lián)。