[發明專利]建立胎盤間充質干細胞庫的方法

有效

• 申請號: 201210044638.6
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102586184A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 霍思維;陳俊峯;張毅;許曉椿;李詣書
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0735;G06F19/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.建立胎盤間充質干細胞庫的方法，該方法包括以下步驟：

(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；

(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37℃孵育消化；

(c)將組織塊用銅網過濾，必要時研磨以促使過濾；

(d)將收集的過濾液離心，分離單個核細胞，再用MSC培養基懸浮所獲得的細胞，然后在37℃、5％CO₂培養箱中培養；

(e)待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養基分別培養，待細胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質干細胞；

(f)針對步驟(e)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中凍存；

(h)建立包含以上信息的胎盤干細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(g)的凍存細胞進行關聯。

2.根據權利要求1的方法，其中所述步驟(a)是在產后四小時之內，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積胎牛血清(FBS)的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。

3.根據權利要求1的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I(DNase?I)、膠原酶IV、透明質酸酶。

4.根據權利要求1的方法，在步驟(b)中，在37℃孵育10～30分鐘，優選10～20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。

5.根據權利要求1的方法，在步驟(d)中，所述MSC培養基是含10％FBS的PBS緩沖液。

6.根據權利要求1的方法，在步驟(e)中，待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養基分別培養，待細胞60～90％融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質干細胞。

7.根據權利要求1的方法，在步驟(f)中，所述細胞污染檢測是利用病原學方法，檢測細胞是否受到選自下列的一項或多項的感染：乙肝兩對半、丙肝、艾滋病毒、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

8.根據權利要求1的方法，在步驟(h)中，所述數據庫中包括與所保存的細胞所有相關的數據，包括：細胞的生物學特性檢測結果、多向分化潛能鑒定結果、細胞分子遺傳學診斷結果、胎兒及其父母的詳細資料。

9.從胎盤中分離間充質干細胞的方法，該方法包括以下步驟：

(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；

(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37℃孵育消化；

(c)將組織塊用銅網過濾，必要時研磨以促使過濾；

(d)將收集的過濾液離心，分離單個核細胞，再用MSC培養基懸浮所獲得的細胞，然后在37℃、5％CO₂培養箱中培養；

(e)待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養基分別培養，待細胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質干細胞；

以及任選的下列一個或多個步驟：

(f)針對步驟(e)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中凍存；

(h)建立包含以上信息的胎盤干細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(g)的凍存細胞進行關聯。

10.一種胎盤間充質干細胞，其是根據權利要求1-9任一項的方法獲得的。