[發明專利]一種腈水解酶及其基因和應用

有效

• 申請號: 201210044367.4
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102533705A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 許建和;張陳勝;潘江;李春秀;張志鈞
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/70;C12P7/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種新的腈水解酶及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，利用重組表達轉化體制備重組酶的方法，以及該重組腈水解酶在水解鄰氯扁桃腈或其結構類似物，制備(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物方面的應用。

背景技術

(R)-鄰氯扁桃酸是抗凝血類藥物氯吡格雷的重要手性中間體。而其類似物是一類重要的手性合成砌塊，被廣泛應用于多種藥物的合成。如頭孢類半合成抗生素、抗腫瘤及抗衰老藥物的重要中間體；也可以作為手性拆分試劑，用于拆分其他的手性藥物或醫藥中間體。

目前研究人員已經開發出多種制備(R)-鄰氯扁桃酸的方法，主要有化學法和生物法。傳統的化學拆分法，主要是利用手性胺類化合物，如α-甲基芐胺、(-)-麻黃堿和辛可寧等，通過與外消旋的鄰氯扁桃酸形成非對映異構體鹽的方法，得到單一對映體的鄰氯扁桃酸。

生物法制備(R)-鄰氯扁桃酸已經成為研究的熱點。例如，酯酶途徑主要有兩種：第一種，是在鄰氯扁桃酸的羥基上酰化，然后由酯酶催化拆分，從而得到光學純的產物和剩余底物(Appl?Microbiol?Biotechnol，2010，86：83-91)。第二種，則是在鄰氯扁桃酸的羧基上甲酯化，然后酶促拆分(Biotechnol?Bioeng，2008，101：460-469)。

除了酯酶催化拆分之外，還有文獻報道了氧化還原酶不對稱還原鄰氯苯甲酰甲酸，生成(R)-鄰氯扁桃酸(J?Chem?Technol?Biot，2009，84：1787-1792)。

腈水解酶能夠催化有機腈化合物一步水解為羧酸并產生等摩爾量的氨，該過程反應條件溫和，不需要任何輔因子的參與，反應效率高，反應過程具有較好的區域和立體選擇性。由于鄰氯扁桃腈易于大規模生產且成本低廉；更為重要的是，當(R)-鄰氯扁桃腈被對映選擇性地酶促水解為(R)-鄰氯扁桃酸后，剩余的(S)-鄰氯扁桃腈在弱堿性條件下可以自發地消旋轉化為外消旋的鄰氯扁桃腈，這樣理論上可以得到100％的產率。因此，獲得對鄰氯扁桃腈具有高水解活性和對映選擇性的腈水解酶，有利于實現(R)-鄰氯扁桃酸的大規模工業化生產。而目前，已知的腈水解酶對于鄰氯扁桃腈的底物耐受性普遍較差，多數在50mmol/L以下(J?Am?Chem?Soc，2002，124：9024-9025；J?Ind?Microbiol?Biotechnol，2010，37：741-750；Enzyme?Microb?Technol，2010，47：140-146)。雖然已有文獻報道腈水解酶能夠在水-甲苯兩相體系中水解200mM鄰氯扁桃腈，但其產率和ee較低，產物濃度157mmol/L，ee＝90.4％(J?Biotechnol，2011，152：24-29)。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種新的水解鄰氯扁桃腈獲得手性(R)-鄰氯扁桃酸的腈水解酶，該腈水解酶在所述催化反應中底物耐受性好，產率和ee值較高，具有催化活性高、對映選擇性強、對環境友好的優點。本發明還提供該腈水解酶基因以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，重組酶的制備方法，以及該重組腈水解酶的應用。

本發明通過下述技術方案解決上述技術問題：

本發明的技術方案之一是：一種腈水解酶，該腈水解酶是如下(a)或(b)的蛋白質；

(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?No.2所示；

(b)在蛋白質(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

蛋白質(b)是在蛋白質(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質。其中，所述的“幾個”是指二個至小于100個，更佳的小于30個。比如添加一個外分泌信號肽的融合蛋白，只要該融合蛋白還是具有腈水解酶活性，本發明發現這樣的融合蛋白同樣可以水解鄰氯扁桃腈獲得手性(R)-鄰氯扁桃酸的腈水解酶，并達到底物耐受性好，產率和ee值較高的效果。也就是說本發明發現只要由(a)衍生的蛋白質具有腈水解酶活性，且衍生方式如上所述，則都可以達到本發明的發明目的。本發明所述的腈水解酶來源于Labrenzia?aggregate，更佳的來源于Labrenzia?aggregate?DSM?13394。所述的腈水解酶可以從Labrenzia?aggregate中分離獲得，也可以從重組表達該腈水解酶的表達子中分離獲得，也可以人工合成獲得。